丁芳芳，田少君，?；勖?，章紹兵

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州450001)

豌豆是僅次于大豆的第二大食用豆科植物，含有20%～30%的蛋白質(zhì)[1]。豌豆蛋白氨基酸組成符合FAO/WHO的建議模式，與大豆蛋白相比，具有相似或者更高的必需氨基酸含量[2-3]，其賴氨酸含量較高，不易致敏，是近年來新興的一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白。但豌豆蛋白在大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)時，蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性，功能性質(zhì)(溶解性、乳化性等)變差，不利于豌豆蛋白的利用。目前我國大多數(shù)廠家商業(yè)生產(chǎn)加工豌豆的重點仍是豌豆淀粉的提取，豌豆蛋白僅作為副產(chǎn)品[4]，造成豌豆蛋白資源的浪費。

超聲波產(chǎn)生的空化作用對蛋白分子可產(chǎn)生機(jī)械性斷鍵，從而影響蛋白的功能特性，使蛋白質(zhì)分散液均勻分布，顯著改善乳狀液的粒徑，提高乳化性[5]。Sui等[6]在超聲功率150 W、超聲時間24 min條件下處理大豆蛋白，乳狀液表現(xiàn)出更好的乳化活性和乳液穩(wěn)定性。Mccarthy等[7]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理1%豌豆蛋白可形成較小液滴的乳狀液。目前，對豌豆蛋白研究較多的是其凝膠性質(zhì)，對不同條件(pH、溫度、酶解、高壓和超聲等)下豌豆蛋白的乳化性也有報道，然而對豌豆蛋白乳狀液在冷藏期間的物理穩(wěn)定性鮮少研究。

本課題采用超聲對豌豆蛋白進(jìn)行改性，并將改性產(chǎn)物制備成乳狀液進(jìn)行冷藏，進(jìn)一步測定乳狀液體系的穩(wěn)定性，包括粒徑、Zeta電位以及儲藏期間絮凝狀態(tài)等理化性質(zhì)，并從改性前后豌豆蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，分析乳化性提高的原因，旨為豌豆蛋白乳狀液的制備及在食品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豌豆蛋白粉，山東煙臺東方蛋白科技有限公司(蛋白質(zhì)濕基含量77.82%)；玉米油，山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司；其他試劑均為化學(xué)純或分析純。

K1160全自動凱氏定氮儀；磁力攪拌器；恒溫水浴振蕩器；722S可見分光光度計；PHS-3C型精密酸度計；LGJ-25型冷凍干燥機(jī)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；高速剪切乳化機(jī)，德國 Fluko流體機(jī)械制造公司；BT-9300激光粒度分布儀；傅里葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；APV-2000 高壓均質(zhì)機(jī)，德國APV儀器公司；正置落射熒光顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 豌豆蛋白基本指標(biāo)的測定

粗蛋白質(zhì)含量測定，GB/T 5009.5—2010，半微量凱氏定氮法；粗脂肪含量測定，GB/T 5009.6—2003，索氏抽提法；水分含量測定，GB/T 5009.3—2010，直接干燥法；灰分含量測定，GB/T 22427.1—2008。

1.2.2 超聲改性豌豆蛋白

用蒸餾水配制一定質(zhì)量濃度的豌豆蛋白溶液，調(diào)pH至7，室溫下磁力攪拌2 h，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中用直徑為0.6 cm的超聲波探頭插入溶液中間深度處理，并確保在超聲過程中探頭處于液面以下同一高度，工作參數(shù)為工作 4 s、間歇 2 s、溫度控制在20℃以下，設(shè)置超聲功率和超聲時間，為減少熱效應(yīng)采用冰水浴進(jìn)行控溫。超聲處理結(jié)束后，一部分豌豆蛋白溶液使用蒸餾水稀釋至5 mg/mL測定其乳化活性和乳化穩(wěn)定性，另一部分豌豆蛋白溶液經(jīng)冷凍干燥用于結(jié)構(gòu)的測定。

1.2.3 豌豆蛋白乳化性的測定

根據(jù)Pearce等[8]的方法稍加改進(jìn)進(jìn)行測定。配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的樣品溶液，取玉米油和上述樣品溶液(體積比1∶6)，置于高速剪切乳化機(jī)中10 000 r/min均質(zhì)2 min，分別在放置0、10 min時，從測試管底部取樣50 μL，用0.1%SDS稀釋100倍，渦旋振蕩10 s，以SDS溶液為空白并測定500 nm處的吸光度。乳化活性(EAI)用0時刻吸光度A500表示，乳化穩(wěn)定性(ESI)用下式計算。

ESI=At/A×100%

式中：A和At分別表示乳液放置0、10 min的吸光度。

1.2.4 豌豆蛋白乳狀液冷藏穩(wěn)定性的測定

使用蒸餾水稀釋最佳超聲改性條件制備的豌豆蛋白、未超聲處理的豌豆蛋白至質(zhì)量濃度為5 mg/mL，分別與大豆油以體積比6∶1混合，于10 000 r/min剪切2 min，然后50 MPa高壓均質(zhì)循環(huán)2次。得到的乳狀液加入0.02%疊氮鈉作為抑菌劑，于4℃貯藏15 d內(nèi)分別測定在儲藏期間的Zeta電位、粒徑變化趨勢，并對其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.2.4.1Zeta電位分析

根據(jù) Chanamai 等[9]的方法，略有改動。取10 μL豌豆蛋白乳狀液，以蒸餾水將乳狀液稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%，采用激光粒度分布儀測定豌豆蛋白乳狀液(25℃)的Zeta電位。

1.2.4.2 粒徑分析

選用激光粒度分布儀測定粒徑，設(shè)定實部折射率1.43，虛部折射率0.1。用膠頭滴管吸取乳狀液緩慢滴加至遮光率為8%～10%，參考實時粒徑變化分析選取測量值，以乳狀液粒徑D50為指標(biāo)。

1.2.4.3 微觀結(jié)構(gòu)的觀測

取出一定量冷藏15 d的豌豆蛋白乳狀液，用適量蒸餾水稀釋，在顯微鏡下放大400倍觀察并分析豌豆蛋白乳狀液的顆粒分布。

1.2.5 傅里葉紅外光譜(FTIR)分析

取2 mg樣品和200 mg KBr混合，研磨均勻后制作透明薄片，以純KBr為參照樣，室溫干燥環(huán)境進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1。對豌豆蛋白的紅外吸收曲線進(jìn)行二級求導(dǎo)，光譜數(shù)據(jù)用Peakfit4.12軟件進(jìn)行分析。參考Wang等[10]的方法對豌豆蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定：α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 650～1 658 cm-1；β-折疊結(jié)構(gòu)，1 600～1 640 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 660～1 700 cm-1；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，1 640～1 650 cm-1。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用IBM SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，如果方差分析差異性顯著(P<0.05)，則使用Duncan’s進(jìn)行多重比較。采用Origin8.5軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲時間的影響

固定豌豆蛋白質(zhì)量濃度為30 mg/mL、超聲功率為300 W，考察超聲時間對豌豆蛋白乳化性的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲時間對豌豆蛋白乳化性的影響

從圖1可以看出，超聲時間在5～30 min的范圍內(nèi)，豌豆蛋白乳化活性逐漸升高，在30 min達(dá)到最大，且乳化活性呈明顯增加的趨勢，而乳化穩(wěn)定性增加幅度較小。當(dāng)超聲時間超過30 min后，乳化活性和乳化穩(wěn)定性稍下降。在一定超聲時間范圍內(nèi)，可溶性蛋白含量增加，乳化能力增強(qiáng)，但超聲時間過長，蛋白質(zhì)變性程度增大，不溶性蛋白含量增多，乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨之降低，這與邵悅等[11]的研究結(jié)果一致。

2.1.2 豌豆蛋白質(zhì)量濃度的影響

固定超聲時間為30 min、超聲功率為300 W，考察豌豆蛋白質(zhì)量濃度對豌豆蛋白乳化性的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 豌豆蛋白質(zhì)量濃度對豌豆蛋白乳化性的影響

從圖2可以看出，豌豆蛋白質(zhì)量濃度在30 mg/mL 時乳化活性和乳化穩(wěn)定性均達(dá)到最大，之后隨著豌豆蛋白質(zhì)量濃度的增加略有下降。可能是因為在乳狀液形成過程中，油水界面上蛋白質(zhì)迅速吸附，兩相的界面張力降低，促進(jìn)乳狀液液滴的形成，并起到油滴保護(hù)膜的作用，防止油滴被破壞，使乳狀液處于穩(wěn)定狀態(tài)[12]，因此隨豌豆蛋白質(zhì)量濃度的增加，乳狀液穩(wěn)定性增加，但當(dāng)達(dá)到豌豆蛋白的飽和濃度后，多余的蛋白由于彼此間的電荷排斥反而會破壞乳狀液的穩(wěn)定性[2]，致使乳化性稍微下降。

2.1.3 超聲功率的影響

固定豌豆蛋白質(zhì)量濃度為30 mg/mL、超聲時間為30 min，考察超聲功率對豌豆蛋白乳化性的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲功率對豌豆蛋白乳化性的影響

從圖3可以看出，豌豆蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均隨著超聲功率的增大而增加，在超聲功率400 W時達(dá)到最大。這可能是因為超聲功率增大時，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，造成空穴，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變得疏松，乳化性提高。但在超聲功率超過400 W后，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)遭到破壞[5]，使原來分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于分子表面，從而乳狀液溶解度降低，乳化性隨之降低。

2.2 正交實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以豌豆蛋白質(zhì)量濃度、超聲功率和超聲時間為因素，以豌豆蛋白的乳化活性為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實驗。正交實驗因素水平見表1，正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表2可知，影響豌豆蛋白乳化活性的各因素主次順序為A>C>B，即豌豆蛋白質(zhì)量濃度>超聲時間>超聲功率。其中，豌豆蛋白質(zhì)量濃度和超聲時間對豌豆蛋白乳化活性具有極顯著和顯著影響。超聲改性最佳條件為A2B3C3，即豌豆蛋白質(zhì)量濃度30 mg/mL、超聲時間40 min、超聲功率500 W時乳化活性最好。在最佳工藝條件下，3次重復(fù)性驗證實驗得到豌豆蛋白乳化活性(A500)為0.331，乳化穩(wěn)定性為72.52%。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析

注：F0.05(3,3)=9.28，F(xiàn)0.01(3,3)=29.46，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2.3 豌豆蛋白乳狀液的冷藏穩(wěn)定性

2.3.1Zeta電位的變化(見圖4)

注：不同字母表示差異顯著。

一般來說，當(dāng)乳狀液Zeta電位絕對值大于25 mV時，乳狀液具有良好的靜電排斥作用，能有效阻止乳狀液在儲藏期間發(fā)生液滴聚集現(xiàn)象。由圖4可以看出：乳狀液液滴表面都帶負(fù)電荷；未改性豌豆蛋白乳狀液Zeta電位絕對值為19 mV，超聲改性豌豆蛋白乳狀液Zeta電位絕對值為27 mV。分析原因是經(jīng)超聲改性后，暴露較多的帶電基團(tuán)，蛋白質(zhì)分子攜帶電荷量增加，因此制得的乳狀液具有更大的Zeta電位絕對值，乳狀液穩(wěn)定性增高[13]。4℃儲藏期內(nèi)，Zeta電位絕對值都有所降低，是由于離子相互作用使得液滴周圍吸附蛋白質(zhì)，導(dǎo)致所有樣品Zeta電位的升高，從而引起靜電斥力的降低。Taha等[14]研究發(fā)現(xiàn)由于蛋白質(zhì)聚集體的形成，Zeta電位絕對值降低，這與本實驗研究結(jié)果一致。對比發(fā)現(xiàn)冷藏期間未改性豌豆蛋白乳狀液Zeta電位變化顯著(-19 mV到-10 mV)，超聲改性豌豆蛋白乳狀液Zeta電位變化較小(-27 mV到-25 mV)，表明超聲改性豌豆蛋白乳狀液冷藏穩(wěn)定性較好。

2.3.2 粒徑的變化(見表4)

表4 超聲改性前后豌豆蛋白乳狀液冷藏期間粒徑的變化

注：不同字母表示差異顯著。

由表4可以看出，未改性豌豆蛋白乳狀液粒徑為19.01 μm，超聲改性豌豆蛋白乳狀液粒徑減小至13.36 μm。因超聲可產(chǎn)生空化，破壞蛋白質(zhì)的疏水和靜電相互作用，防止聚集物形成，促進(jìn)小顆粒形成，從而促使蛋白質(zhì)吸附在均質(zhì)化過程的油滴表面。粒徑的減小是因為具有較小尺寸的蛋白質(zhì)更快地擴(kuò)散到油滴表面，并且更容易重新排列以減少界面張力。Zhu等[15]研究超聲作用核桃蛋白使得乳狀液乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性增加，樣品形成較小的液滴，這與本實驗結(jié)果一致。隨著冷藏(4℃)時間延長，乳狀液粒徑都有所增加，這是因為乳狀液界面的靜電屏蔽導(dǎo)致液滴間的排斥力降低，液滴發(fā)生部分聚集，使得乳狀液平均粒徑增加，儲藏穩(wěn)定性變差[16]。未改性豌豆蛋白乳狀液平均粒徑增加顯著，超聲改性豌豆蛋白乳狀液平均粒徑增長速度緩慢。結(jié)果表明超聲改性豌豆蛋白能夠顯著降低乳狀液在冷藏期間的粒徑變化率。

2.3.3 乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)(見圖5)

由圖5可以看出，未改性豌豆蛋白乳狀液冷藏15 d后發(fā)生明顯絮凝，乳狀液彼此聚集粘連成一團(tuán)。超聲改性豌豆蛋白乳狀液相對穩(wěn)定，有少量液滴發(fā)生聚集，液滴分散均勻，大小均一，呈現(xiàn)顆粒分明的狀態(tài)。實驗發(fā)現(xiàn)，乳狀液粒徑越小、Zeta電位絕對值越大，乳狀液的絮凝現(xiàn)象越不明顯。從微觀角度證實了乳化性越高，液滴粒徑越小，乳狀液越穩(wěn)定的結(jié)論。

圖5 未改性豌豆蛋白乳狀液(A)與超聲改性豌豆蛋白乳狀液(B)的微觀結(jié)構(gòu)

2.4 超聲改性前后豌豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)(見表5)

表5 超聲改性前后豌豆蛋白的二級結(jié)構(gòu) %

由表5可以看出，經(jīng)超聲改性后，豌豆蛋白β-折疊和無規(guī)卷曲含量增加，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量減小，這與?；勖舻萚17]的研究結(jié)果一致。β-折疊和無規(guī)卷曲含量與表面疏水性呈正相關(guān)，表明蛋白質(zhì)變得更加疏松與伸展。α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量減少，增加了分子柔性，從而表現(xiàn)為乳狀液中蛋白質(zhì)能迅速吸附至油水界面，穩(wěn)定更大的界面面積，與前文的乳狀液粒徑減小、Zeta電位絕對值增大和未發(fā)生明顯絮凝現(xiàn)象相一致。表明超聲處理能改善豌豆蛋白的功能特性，進(jìn)而增加乳狀液的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

正交實驗優(yōu)化得到豌豆蛋白超聲改性最佳工藝條件為超聲功率500 W、超聲時間40 min、豌豆蛋白質(zhì)量濃度30 mg/mL，在此條件下超聲改性豌豆蛋白乳化活性(A500)為0.331，乳化穩(wěn)定性為72.52%。超聲改性豌豆蛋白乳狀液表現(xiàn)為較小的粒徑、較大的Zeta電位絕對值，無明顯的絮凝現(xiàn)象，表明超聲改性豌豆蛋白具有良好的冷藏穩(wěn)定性。豌豆蛋白經(jīng)超聲改性后，β-折疊和無規(guī)卷曲含量增加，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量減小，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展和重組，分子柔性增強(qiáng)。二級結(jié)構(gòu)的變化說明超聲改性改善了豌豆蛋白的乳化性。