顏東瓊,章紹兵,和文昭
(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,鄭州450001)
大豆蛋白含有平衡的氨基酸組成和豐富的賴氨酸,能增加總膳食蛋白質(zhì)攝入量并減少碳水化合物或脂肪攝入量和降低膽固醇等,可預(yù)防肥胖、糖尿病和腎臟疾病等,與小麥蛋白營養(yǎng)互補(bǔ),是人類飲食中重要的食物蛋白之一[1]。大豆中的生物活性成分逐漸在食品中得到應(yīng)用,并加工制成各種保健品,同時(shí)也普遍應(yīng)用于輕工業(yè)和化妝品中[2-3]。
20世紀(jì)80年代末,表面活性劑被發(fā)現(xiàn)加入牛奶制品(攪打奶油和冰淇淋)中可以促進(jìn)脂肪球的聚結(jié)。為了探尋其中的機(jī)制,蛋白質(zhì)(主要是牛奶蛋白質(zhì))和表面活性劑的界面相互作用逐漸受到研究者的重視。Dalgleish等[4]發(fā)現(xiàn)吐溫60與酪蛋白的摩爾比高達(dá)90∶1時(shí),界面蛋白質(zhì)僅部分被取代,當(dāng)吐溫60濃度進(jìn)一步增加時(shí),酪蛋白吸附層的厚度和油滴電位均降低。有研究表明[5-6],當(dāng)體系中表面活性劑和蛋白質(zhì)濃度比達(dá)到或超過一定程度時(shí),界面蛋白質(zhì)才能夠被表面活性劑部分或完全取代,但是蛋白質(zhì)種類不同其被取代的難易程度有差異。大豆分離蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源,不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,還具有較好的乳化性、凝膠性和起泡性。Diftis等[7]研究了大豆分離蛋白-葡聚糖混合物和表面活性劑之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)干燥加熱的大豆分離蛋白-葡聚糖混合物與低分子表面活性劑競(jìng)爭吸附導(dǎo)致吸附在油滴表面的大豆分離蛋白減少。
盡管前人已對(duì)模擬乳液體系中表面活性劑取代界面蛋白質(zhì)的能力及微觀過程開展了較多研究,但通常僅局限于分析表面活性劑類型、蛋白質(zhì)種類或表面活性劑與蛋白質(zhì)濃度比對(duì)界面蛋白取代率的影響,沒有探究乳液中鹽離子濃度及乳液體系的pH等關(guān)鍵環(huán)境因素對(duì)界面蛋白取代率的影響規(guī)律。本文以大豆分離蛋白和吐溫20為研究對(duì)象,分析影響界面蛋白取代率及乳液穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素(吐溫20添加量、乳液pH及離子強(qiáng)度、吐溫20添加次序等),為進(jìn)一步探索表面活性劑取代界面蛋白質(zhì)的機(jī)制提供理論依據(jù)。
大豆分離蛋白:實(shí)驗(yàn)室自制(蛋白質(zhì)含量為82.3%,N=5.71)。大豆油:中糧黃海糧油工業(yè)有限公司。其他試劑均為分析純。
TG1850-WS離心機(jī);FA25高速乳化均質(zhì)機(jī);BT-9300S激光粒度分布儀;KDN-1凱氏定氮儀;FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司。
1.2.1 大豆蛋白乳液制備及單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
參照李偉偉[8]的方法制備大豆蛋白乳液。精確稱取1 g大豆分離蛋白,溶解于80 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中,室溫下磁力攪拌2 h制備蛋白溶液,取20 mL大豆油與蛋白溶液混合,在高速乳化均質(zhì)機(jī)10 000 r/min下乳化4 min,得到大豆蛋白乳液。通過改變吐溫20添加量、調(diào)節(jié)pH及NaCl濃度、改變吐溫20添加次序,分析關(guān)鍵環(huán)境因素對(duì)吐溫20取代大豆分離蛋白的影響。
1.2.2 大豆蛋白乳液粒徑測(cè)定
選用激光粒度分布儀測(cè)定大豆蛋白乳液粒徑,設(shè)定物質(zhì)折射率實(shí)部1.472,物質(zhì)折射率虛部0.1,介質(zhì)折射率1.333。用滴管吸取大豆蛋白乳液用蒸餾水稀釋內(nèi)循環(huán)緩慢滴加至遮光率5%~7%之間,采用自動(dòng)測(cè)試模式測(cè)定粒徑。以乳液粒徑D3,2為指標(biāo)進(jìn)行分析。
1.2.3 界面吸附蛋白濃度及界面蛋白取代率的測(cè)定
參照Zhang等[9]的方法,稍作修改。將大豆蛋白乳液振蕩后,取25 mL于離心管中,室溫下12 000 r/min離心30 min。用注射器小心移取下層清液至另一個(gè)新的離心管中,再次離心(12 000 r/min,30 min),收集下層清液。用凱氏定氮法測(cè)定清液中蛋白質(zhì)含量(N=5.71)。界面吸附蛋白濃度(Γ)按照公式(1)計(jì)算。
(1)
式中:Γ為界面吸附蛋白濃度,mg/m2;MP/O為吸附蛋白與油質(zhì)量比;SSA為油滴的比表面積。
SSA按照公式(2)計(jì)算。
(2)
式中:D3,2為乳液粒徑;ρoil為大豆油密度,0.917 g/cm3。
界面蛋白取代率按公式(3)計(jì)算。
(3)
式中:M0為未加吐溫吸附蛋白的質(zhì)量,g;M1為加吐溫后吸附蛋白的質(zhì)量,g。
1.2.4 大豆蛋白乳液的微觀結(jié)構(gòu)觀察
采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察大豆蛋白乳液的微觀結(jié)構(gòu)。借鑒Heilig等[10]的方法稍作改動(dòng)。將均質(zhì)前吐溫20添加量(w吐溫20/v乳液,下同)分別為0%和1%的乳液離心去除水層,4℃放置1 d后取乳化層稀釋10倍后,取1 mL加入10 μL異硫氰酸熒光素(FITC),混合均勻,取8 μL到載坡片上并蓋上蓋玻片,觀察時(shí)倒置于激光掃描共聚焦顯微鏡的卡槽上。FITC的激發(fā)波長為488 nm,圖像分辨率為1 024×1 024。
1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
所有試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件。
在1.2.1制備的大豆蛋白乳液中分別添加0%~2%的吐溫20,混合均勻,水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩1 h,考察吐溫20添加量對(duì)取代界面大豆分離蛋白的影響,結(jié)果見圖1、圖2。
注:圖中不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05),下同。
圖1 吐溫20添加量對(duì)Γ的影響
圖2 吐溫20添加量對(duì)界面蛋白取代率的影響
Chabrand等[11]報(bào)道,在水劑法(AEP)期間形成的大豆蛋白乳液的Γ較高,為14.65 mg/m2。Tcholakova等[12]指出,1~2 mg/m2的Γ是形成單層油滴的最小覆蓋率,以確保乳液的穩(wěn)定。Puppo[13]、Guo[14]等分別報(bào)道,大豆分離蛋白乳液中的飽和Γ為3.03 mg/m2,甘薯蛋白乳液中的飽和Γ為1.81 mg/m2。由圖1可知,不添加吐溫20大豆蛋白乳液的Γ為5.90 mg/m2,說明大豆油滴界面覆蓋了多層蛋白質(zhì)。隨著吐溫20添加量的加大,大豆蛋白被吐溫20從界面取代下來,油水界面蛋白含量降低,在吐溫20添加量為1%時(shí),Γ最小,為3.02 mg/m2,接近大豆蛋白乳液中油滴表面單層的飽和覆蓋量(1~2 mg/m2)。這說明油滴表面蛋白因?yàn)橥聹?0作用后已經(jīng)從多層吸附變?yōu)閱螌游?。由圖2可知:吐溫20添加量在0.05%~1%時(shí),隨著吐溫20添加量的增加,大豆蛋白被吐溫20從界面上取代下來,取代率逐漸增大;在吐溫20添加量為1%時(shí),取代率最高,為48.87%,再加大吐溫20添加量,取代率基本不變。說明吐溫20不能完全將大豆蛋白從界面取代下來,這與Yi等[15]報(bào)道中即使在最高表面活性劑添加水平(1%吐溫20)下,仍然存在一些吸附的酪蛋白(0.07 mg/m2)結(jié)果相似。但兩者取代后的Γ差異比較大,可能與蛋白分子形狀不同有關(guān),大豆蛋白是球蛋白,結(jié)構(gòu)緊密,而酪蛋白是線狀蛋白,分子柔性好,表面疏水性強(qiáng),可能更容易與吐溫20結(jié)合而被取代。
在1.2.1制備的大豆蛋白乳液中不添加和添加0.5%的吐溫20,將乳液pH分別調(diào)至3、7、9和11,水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 min,考察pH對(duì)吐溫20取代界面大豆分離蛋白的影響,結(jié)果見圖3、圖4。
圖3 pH對(duì)Γ的影響
圖4 pH對(duì)界面蛋白取代率的影響
由圖3可知,對(duì)于不添加吐溫20的大豆蛋白乳液,隨著pH升高Γ逐漸降低。分析原因可能是酸性pH接近大豆蛋白的等電點(diǎn),大豆蛋白分子之間的相互排斥作用較弱,導(dǎo)致Γ顯著增加,此外pH 3時(shí)水相中蛋白質(zhì)可能會(huì)發(fā)生變性而疏水性增強(qiáng)[16],從而更容易吸附到界面上;而堿性條件遠(yuǎn)離大豆蛋白的等電點(diǎn),分子間排斥作用強(qiáng),導(dǎo)致Γ降低。加入吐溫20后,中性或堿性條件下大豆蛋白乳液的Γ均顯著降低,但pH 3時(shí)Γ卻不降反升,可能有兩個(gè)方面的原因:①在酸性條件下,蛋白分子形成的界面膜更加致密牢固,即使加入吐溫20,對(duì)界面蛋白的取代作用十分有限;②pH 3時(shí)水相中蛋白質(zhì)發(fā)生變性,分子展開后疏水基團(tuán)和界面上的吐溫20相互作用增強(qiáng),導(dǎo)致Γ增加[17]。由圖4可知,在中性或堿性條件下,界面蛋白易被吐溫20取代,可能由于在高pH條件下界面上蛋白質(zhì)分子之間相互排斥作用加劇,導(dǎo)致形成的界面膜機(jī)械強(qiáng)度低,因而容易被小分子表面活性劑通過競(jìng)爭吸附所取代。在pH為7~9時(shí),取代率都比較高,而pH為11時(shí)取代率降低,這是由于pH 11條件下,未加吐溫20時(shí)乳液的Γ(3.21 mg/m2)就已經(jīng)很低。
按照1.2.1方法,采用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解大豆分離蛋白,避免磷酸鹽濃度過大對(duì)NaCl作用產(chǎn)生干擾,在不添加吐溫20和吐溫20添加量為0.5%的乳液中分別加入NaCl,使NaCl濃度在0~0.9 mol/L,水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 mim,考察離子強(qiáng)度對(duì)吐溫20取代界面大豆分離蛋白的影響,結(jié)果見圖5、圖6。
圖5 NaCl濃度對(duì)Γ的影響
圖6 NaCl濃度對(duì)界面蛋白取代率的影響
由圖5可知,不添加吐溫20時(shí)添加0.1 mol/L NaCl的乳液Γ較大,而加大NaCl濃度后Γ減小(可能與鹽溶作用增強(qiáng)有關(guān))。與不添加NaCl相比,添加NaCl的乳液Γ升高,可能是因?yàn)樘岣唠x子強(qiáng)度會(huì)掩蔽蛋白質(zhì)自身所帶的電荷[18],減少界面上分子間靜電排斥所致。加入0.5%吐溫20后,Γ隨NaCl濃度的增大有輕微增加趨勢(shì),但變化不顯著,與未添加吐溫20的乳液相比前者Γ均顯著下降。由圖6可知,在NaCl濃度為0.1 mol/L時(shí),界面蛋白取代率最高,無NaCl或NaCl濃度過高都沒有獲得較高的取代率。
按1.2.1方法均質(zhì)前在蛋白溶液中添加0%~2%吐溫20制備大豆蛋白乳液,水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 min,考察均質(zhì)前添加吐溫20對(duì)吐溫20取代界面大豆分離蛋白的影響,結(jié)果見圖7、圖8。
圖7 均質(zhì)前添加吐溫20對(duì)Γ的影響
圖8 均質(zhì)前添加吐溫20對(duì)界面蛋白取代率的影響
由圖7可知,均質(zhì)前添加吐溫20,Γ顯著降低,但增大吐溫20添加量后Γ無顯著性差異,這與圖1中均質(zhì)后增大吐溫20添加量能使Γ逐漸降低的結(jié)果不同。由圖8可知:吐溫20添加量在0.05%~0.3%時(shí),界面蛋白取代率較低;吐溫20添加量在0.4%~0.5%時(shí),取代率較高,再加大吐溫20添加量到1%~2%,取代率反而變小,這與圖2中吐溫20高添加量時(shí)取代率基本保持不變的結(jié)果有所差異。與均質(zhì)后添加吐溫20試驗(yàn)結(jié)果相比(界面蛋白最高取代率為48.87%),均質(zhì)前添加吐溫20界面蛋白的最高取代率僅有33.93%。這說明吐溫20添加次序顯著影響乳液界面蛋白的取代程度。
在1.2.1制備的大豆蛋白乳液中分別添加0%、0.05%、0.15%、0.2%、1.0%的吐溫20,混合均勻,水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 min。按1.2.1方法均質(zhì)前在蛋白溶液中分別添加0%、0.05%、0.15%、0.2%、1.0%的吐溫20制備大豆蛋白乳液,水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 min??疾焱聹?0添加次序?qū)θ橐毫降挠绊?,結(jié)果見圖9。
圖9 吐溫20添加次序?qū)θ橐毫降挠绊?/p>
由圖9可知,均質(zhì)前添加吐溫20,吐溫20添加量對(duì)新鮮乳液粒徑無顯著影響。而均質(zhì)后添加少量吐溫20就能使乳液粒徑顯著變小,吐溫20添加量超過0.15%后,再加大吐溫20添加量,粒徑無明顯變化。吐溫20在乳化過程中會(huì)和蛋白質(zhì)進(jìn)行界面競(jìng)爭吸附,如果制備O/W型乳液時(shí)在均質(zhì)前添加吐溫20,由于小分子表面活性劑的界面吸附速度快于蛋白質(zhì)分子,形成的吐溫20-蛋白質(zhì)復(fù)合界面膜近油相表面可能以吐溫20分子為主,而近水相表面則以蛋白質(zhì)分子為主。如果在均質(zhì)后添加吐溫20,乳化過程中只有蛋白質(zhì)分子參與界面膜的形成,隨著后期吐溫20分子的界面取代作用,形成的吐溫20-蛋白質(zhì)復(fù)合界面膜近水相表面可能會(huì)覆蓋大量的吐溫20分子。這些吐溫20分子有效降低了油滴之間界面蛋白的疏水相互作用,從而阻止了油滴的相互聚集。這可能是均質(zhì)后添加吐溫20使乳液粒徑顯著變小的主要原因。
圖10、圖11分別為均質(zhì)前后添加吐溫20的大豆蛋白乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性情況。
注:從左到右吐溫20添加量分別為0%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%。
圖10 均質(zhì)前添加吐溫20的乳液儲(chǔ)藏期情況
注:從左到右吐溫20添加量分別為0%、0.05%、0.15%、0.2%、1.0%。
圖11 均質(zhì)后添加吐溫20的乳液儲(chǔ)藏期情況
由圖10可知,均質(zhì)前不同吐溫20添加量樣品之間的短期乳化穩(wěn)定性差異較大,吐溫20低添加量下乳液穩(wěn)定性比吐溫20高添加量時(shí)好,吐溫20的存在顯著降低了乳液穩(wěn)定性。
由圖11可知:新鮮乳液均未出現(xiàn)分層情況;乳液放置4 h后開始分層;放置8 h后,有明顯分層,繼續(xù)放置至24 h,乳液基本無變化。由試驗(yàn)結(jié)果可知,均質(zhì)后無論添加吐溫20與否,乳液的短期儲(chǔ)藏穩(wěn)定性差異較小,各樣品分層都較快,這可能是因?yàn)橹苽淙橐簳r(shí)吐溫20未參與高壓均質(zhì)所致。
綜合以上結(jié)果可知,不論是均質(zhì)前還是均質(zhì)后添加吐溫20,大豆蛋白乳液的界面蛋白都會(huì)被部分取代,但是添加次序?qū)θ橐悍€(wěn)定性的影響顯著不同。推測(cè)其原因可能是:均質(zhì)前添加吐溫20,由于吐溫20分子在均質(zhì)時(shí)快速吸附到界面(蛋白質(zhì)吸附慢),油滴界面膜很難擁有相對(duì)完整的蛋白質(zhì)吸附層,這將導(dǎo)致乳液快速發(fā)生分層(圖10);均質(zhì)后添加吐溫20,吐溫20分子對(duì)油滴界面蛋白質(zhì)的取代是從界面膜近水相表面開始,雖然部分蛋白會(huì)被取代,但最終界面膜近油相表面仍可能保持相對(duì)完整的蛋白質(zhì)吸附層,乳液不至于很快失穩(wěn)分層(圖11)。Kaltsa等[19]研究了不同比例乳清蛋白(WPI)與吐溫20穩(wěn)定的O/W型乳液的相分離(均質(zhì)前添加),發(fā)現(xiàn)兩周之內(nèi),不同混合比例形成的乳液穩(wěn)定性都較好,吐溫20含量的高低并不影響乳液穩(wěn)定性。這與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異,原因可能與乳化劑種類及乳化方式不同有關(guān)。
FITC可與蛋白質(zhì)分子的游離氨基發(fā)生親核反應(yīng),通過共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定顯綠色熒光的偶聯(lián)物[10]。用0.01%FITC分別染色均質(zhì)前吐溫20添加量為0%和1%的大豆蛋白乳液,其激光共聚焦圖片見圖12。
注:(a)為吐溫20添加量0%;(b)為吐溫20添加量1%。
圖12 大豆蛋白乳液的激光共聚焦圖片
由圖12可知,未加入吐溫20的大豆蛋白乳液油滴四周有明顯的光暈,說明油滴的界面層含有較多的蛋白質(zhì)。而加入1%吐溫20后,在相同染色條件下油滴四周幾乎看不到光暈,說明界面吸附蛋白含量較未加入吐溫20的樣品顯著減少,說明吐溫20能將部分蛋白從界面取代下來。
吐溫20添加量、乳液中NaCl強(qiáng)度及乳液體系的pH等均能影響界面蛋白的取代率,但吐溫20不能將大豆分離蛋白完全從界面取代,這可能與大豆蛋白具有較緊密的構(gòu)象有關(guān)。吐溫20添加次序?qū)缑娴鞍椎娜〈始叭橐悍€(wěn)定性的影響顯著不同。均質(zhì)后添加吐溫20,界面蛋白的最高取代率為48.87%,而均質(zhì)前添加吐溫20,界面蛋白的最高取代率為33.93%。在當(dāng)前大豆蛋白乳液制備條件下,均質(zhì)后添加吐溫20幾乎不影響乳液穩(wěn)定性,而均質(zhì)前添加吐溫20則隨著吐溫20添加量增加乳液失穩(wěn)更快。通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),加入吐溫20后的乳液界面吸附蛋白層明顯變薄。