顏東瓊，章紹兵，和文昭

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州450001)

大豆蛋白含有平衡的氨基酸組成和豐富的賴氨酸，能增加總膳食蛋白質(zhì)攝入量并減少碳水化合物或脂肪攝入量和降低膽固醇等，可預(yù)防肥胖、糖尿病和腎臟疾病等，與小麥蛋白營養(yǎng)互補(bǔ)，是人類飲食中重要的食物蛋白之一[1]。大豆中的生物活性成分逐漸在食品中得到應(yīng)用，并加工制成各種保健品，同時(shí)也普遍應(yīng)用于輕工業(yè)和化妝品中[2-3]。

20世紀(jì)80年代末，表面活性劑被發(fā)現(xiàn)加入牛奶制品(攪打奶油和冰淇淋)中可以促進(jìn)脂肪球的聚結(jié)。為了探尋其中的機(jī)制，蛋白質(zhì)(主要是牛奶蛋白質(zhì))和表面活性劑的界面相互作用逐漸受到研究者的重視。Dalgleish等[4]發(fā)現(xiàn)吐溫60與酪蛋白的摩爾比高達(dá)90∶1時(shí)，界面蛋白質(zhì)僅部分被取代，當(dāng)吐溫60濃度進(jìn)一步增加時(shí)，酪蛋白吸附層的厚度和油滴電位均降低。有研究表明[5-6]，當(dāng)體系中表面活性劑和蛋白質(zhì)濃度比達(dá)到或超過一定程度時(shí)，界面蛋白質(zhì)才能夠被表面活性劑部分或完全取代，但是蛋白質(zhì)種類不同其被取代的難易程度有差異。大豆分離蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，還具有較好的乳化性、凝膠性和起泡性。Diftis等[7]研究了大豆分離蛋白-葡聚糖混合物和表面活性劑之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)干燥加熱的大豆分離蛋白-葡聚糖混合物與低分子表面活性劑競(jìng)爭吸附導(dǎo)致吸附在油滴表面的大豆分離蛋白減少。

盡管前人已對(duì)模擬乳液體系中表面活性劑取代界面蛋白質(zhì)的能力及微觀過程開展了較多研究，但通常僅局限于分析表面活性劑類型、蛋白質(zhì)種類或表面活性劑與蛋白質(zhì)濃度比對(duì)界面蛋白取代率的影響，沒有探究乳液中鹽離子濃度及乳液體系的pH等關(guān)鍵環(huán)境因素對(duì)界面蛋白取代率的影響規(guī)律。本文以大豆分離蛋白和吐溫20為研究對(duì)象，分析影響界面蛋白取代率及乳液穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素(吐溫20添加量、乳液pH及離子強(qiáng)度、吐溫20添加次序等)，為進(jìn)一步探索表面活性劑取代界面蛋白質(zhì)的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆分離蛋白：實(shí)驗(yàn)室自制(蛋白質(zhì)含量為82.3%，N=5.71)。大豆油：中糧黃海糧油工業(yè)有限公司。其他試劑均為分析純。

TG1850-WS離心機(jī)；FA25高速乳化均質(zhì)機(jī)；BT-9300S激光粒度分布儀；KDN-1凱氏定氮儀；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆蛋白乳液制備及單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照李偉偉[8]的方法制備大豆蛋白乳液。精確稱取1 g大豆分離蛋白，溶解于80 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，室溫下磁力攪拌2 h制備蛋白溶液，取20 mL大豆油與蛋白溶液混合，在高速乳化均質(zhì)機(jī)10 000 r/min下乳化4 min，得到大豆蛋白乳液。通過改變吐溫20添加量、調(diào)節(jié)pH及NaCl濃度、改變吐溫20添加次序，分析關(guān)鍵環(huán)境因素對(duì)吐溫20取代大豆分離蛋白的影響。

1.2.2 大豆蛋白乳液粒徑測(cè)定

選用激光粒度分布儀測(cè)定大豆蛋白乳液粒徑，設(shè)定物質(zhì)折射率實(shí)部1.472，物質(zhì)折射率虛部0.1，介質(zhì)折射率1.333。用滴管吸取大豆蛋白乳液用蒸餾水稀釋內(nèi)循環(huán)緩慢滴加至遮光率5%～7%之間，采用自動(dòng)測(cè)試模式測(cè)定粒徑。以乳液粒徑D3,2為指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.2.3 界面吸附蛋白濃度及界面蛋白取代率的測(cè)定

參照Zhang等[9]的方法，稍作修改。將大豆蛋白乳液振蕩后，取25 mL于離心管中，室溫下12 000 r/min離心30 min。用注射器小心移取下層清液至另一個(gè)新的離心管中，再次離心(12 000 r/min,30 min)，收集下層清液。用凱氏定氮法測(cè)定清液中蛋白質(zhì)含量(N=5.71)。界面吸附蛋白濃度(Γ)按照公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：Γ為界面吸附蛋白濃度，mg/m2；MP/O為吸附蛋白與油質(zhì)量比；SSA為油滴的比表面積。

SSA按照公式(2)計(jì)算。

(2)

式中：D3,2為乳液粒徑;ρoil為大豆油密度，0.917 g/cm3。

界面蛋白取代率按公式(3)計(jì)算。

(3)

式中：M0為未加吐溫吸附蛋白的質(zhì)量，g；M1為加吐溫后吸附蛋白的質(zhì)量，g。

1.2.4 大豆蛋白乳液的微觀結(jié)構(gòu)觀察

采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察大豆蛋白乳液的微觀結(jié)構(gòu)。借鑒Heilig等[10]的方法稍作改動(dòng)。將均質(zhì)前吐溫20添加量(w吐溫20/v乳液，下同)分別為0%和1%的乳液離心去除水層，4℃放置1 d后取乳化層稀釋10倍后，取1 mL加入10 μL異硫氰酸熒光素(FITC)，混合均勻，取8 μL到載坡片上并蓋上蓋玻片，觀察時(shí)倒置于激光掃描共聚焦顯微鏡的卡槽上。FITC的激發(fā)波長為488 nm，圖像分辨率為1 024×1 024。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 吐溫20添加量對(duì)取代界面大豆分離蛋白的影響

在1.2.1制備的大豆蛋白乳液中分別添加0%～2%的吐溫20，混合均勻，水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩1 h，考察吐溫20添加量對(duì)取代界面大豆分離蛋白的影響，結(jié)果見圖1、圖2。

注：圖中不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)，下同。

圖1 吐溫20添加量對(duì)Γ的影響

圖2 吐溫20添加量對(duì)界面蛋白取代率的影響

Chabrand等[11]報(bào)道，在水劑法(AEP)期間形成的大豆蛋白乳液的Γ較高，為14.65 mg/m2。Tcholakova等[12]指出，1～2 mg/m2的Γ是形成單層油滴的最小覆蓋率，以確保乳液的穩(wěn)定。Puppo[13]、Guo[14]等分別報(bào)道，大豆分離蛋白乳液中的飽和Γ為3.03 mg/m2，甘薯蛋白乳液中的飽和Γ為1.81 mg/m2。由圖1可知，不添加吐溫20大豆蛋白乳液的Γ為5.90 mg/m2，說明大豆油滴界面覆蓋了多層蛋白質(zhì)。隨著吐溫20添加量的加大，大豆蛋白被吐溫20從界面取代下來，油水界面蛋白含量降低，在吐溫20添加量為1%時(shí)，Γ最小，為3.02 mg/m2，接近大豆蛋白乳液中油滴表面單層的飽和覆蓋量(1～2 mg/m2)。這說明油滴表面蛋白因?yàn)橥聹?0作用后已經(jīng)從多層吸附變?yōu)閱螌游?。由圖2可知：吐溫20添加量在0.05%～1%時(shí)，隨著吐溫20添加量的增加，大豆蛋白被吐溫20從界面上取代下來，取代率逐漸增大；在吐溫20添加量為1%時(shí)，取代率最高，為48.87%，再加大吐溫20添加量，取代率基本不變。說明吐溫20不能完全將大豆蛋白從界面取代下來，這與Yi等[15]報(bào)道中即使在最高表面活性劑添加水平(1%吐溫20)下，仍然存在一些吸附的酪蛋白(0.07 mg/m2)結(jié)果相似。但兩者取代后的Γ差異比較大，可能與蛋白分子形狀不同有關(guān)，大豆蛋白是球蛋白，結(jié)構(gòu)緊密，而酪蛋白是線狀蛋白，分子柔性好，表面疏水性強(qiáng)，可能更容易與吐溫20結(jié)合而被取代。

2.2 pH對(duì)取代界面大豆分離蛋白的影響

在1.2.1制備的大豆蛋白乳液中不添加和添加0.5%的吐溫20，將乳液pH分別調(diào)至3、7、9和11，水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 min，考察pH對(duì)吐溫20取代界面大豆分離蛋白的影響，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 pH對(duì)Γ的影響

圖4 pH對(duì)界面蛋白取代率的影響

由圖3可知，對(duì)于不添加吐溫20的大豆蛋白乳液，隨著pH升高Γ逐漸降低。分析原因可能是酸性pH接近大豆蛋白的等電點(diǎn)，大豆蛋白分子之間的相互排斥作用較弱，導(dǎo)致Γ顯著增加，此外pH 3時(shí)水相中蛋白質(zhì)可能會(huì)發(fā)生變性而疏水性增強(qiáng)[16]，從而更容易吸附到界面上；而堿性條件遠(yuǎn)離大豆蛋白的等電點(diǎn)，分子間排斥作用強(qiáng)，導(dǎo)致Γ降低。加入吐溫20后，中性或堿性條件下大豆蛋白乳液的Γ均顯著降低，但pH 3時(shí)Γ卻不降反升，可能有兩個(gè)方面的原因：①在酸性條件下，蛋白分子形成的界面膜更加致密牢固，即使加入吐溫20，對(duì)界面蛋白的取代作用十分有限；②pH 3時(shí)水相中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，分子展開后疏水基團(tuán)和界面上的吐溫20相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致Γ增加[17]。由圖4可知，在中性或堿性條件下，界面蛋白易被吐溫20取代，可能由于在高pH條件下界面上蛋白質(zhì)分子之間相互排斥作用加劇，導(dǎo)致形成的界面膜機(jī)械強(qiáng)度低，因而容易被小分子表面活性劑通過競(jìng)爭吸附所取代。在pH為7～9時(shí)，取代率都比較高，而pH為11時(shí)取代率降低，這是由于pH 11條件下，未加吐溫20時(shí)乳液的Γ(3.21 mg/m2)就已經(jīng)很低。

2.3 離子強(qiáng)度對(duì)吐溫20取代界面大豆分離蛋白的影響

按照1.2.1方法，采用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解大豆分離蛋白，避免磷酸鹽濃度過大對(duì)NaCl作用產(chǎn)生干擾，在不添加吐溫20和吐溫20添加量為0.5%的乳液中分別加入NaCl，使NaCl濃度在0～0.9 mol/L，水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 mim，考察離子強(qiáng)度對(duì)吐溫20取代界面大豆分離蛋白的影響，結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 NaCl濃度對(duì)Γ的影響

圖6 NaCl濃度對(duì)界面蛋白取代率的影響

由圖5可知，不添加吐溫20時(shí)添加0.1 mol/L NaCl的乳液Γ較大，而加大NaCl濃度后Γ減小(可能與鹽溶作用增強(qiáng)有關(guān))。與不添加NaCl相比，添加NaCl的乳液Γ升高，可能是因?yàn)樘岣唠x子強(qiáng)度會(huì)掩蔽蛋白質(zhì)自身所帶的電荷[18]，減少界面上分子間靜電排斥所致。加入0.5%吐溫20后，Γ隨NaCl濃度的增大有輕微增加趨勢(shì)，但變化不顯著，與未添加吐溫20的乳液相比前者Γ均顯著下降。由圖6可知，在NaCl濃度為0.1 mol/L時(shí)，界面蛋白取代率最高，無NaCl或NaCl濃度過高都沒有獲得較高的取代率。

2.4 均質(zhì)前添加吐溫20對(duì)吐溫20取代界面大豆分離蛋白的影響

按1.2.1方法均質(zhì)前在蛋白溶液中添加0%～2%吐溫20制備大豆蛋白乳液，水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 min，考察均質(zhì)前添加吐溫20對(duì)吐溫20取代界面大豆分離蛋白的影響，結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 均質(zhì)前添加吐溫20對(duì)Γ的影響

圖8 均質(zhì)前添加吐溫20對(duì)界面蛋白取代率的影響

由圖7可知，均質(zhì)前添加吐溫20，Γ顯著降低，但增大吐溫20添加量后Γ無顯著性差異，這與圖1中均質(zhì)后增大吐溫20添加量能使Γ逐漸降低的結(jié)果不同。由圖8可知：吐溫20添加量在0.05%～0.3%時(shí)，界面蛋白取代率較低；吐溫20添加量在0.4%～0.5%時(shí)，取代率較高，再加大吐溫20添加量到1%～2%，取代率反而變小，這與圖2中吐溫20高添加量時(shí)取代率基本保持不變的結(jié)果有所差異。與均質(zhì)后添加吐溫20試驗(yàn)結(jié)果相比(界面蛋白最高取代率為48.87%)，均質(zhì)前添加吐溫20界面蛋白的最高取代率僅有33.93%。這說明吐溫20添加次序顯著影響乳液界面蛋白的取代程度。

2.5 大豆蛋白乳液的粒徑及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

在1.2.1制備的大豆蛋白乳液中分別添加0%、0.05%、0.15%、0.2%、1.0%的吐溫20，混合均勻，水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 min。按1.2.1方法均質(zhì)前在蛋白溶液中分別添加0%、0.05%、0.15%、0.2%、1.0%的吐溫20制備大豆蛋白乳液，水浴恒溫振蕩器100 r/min振蕩30 min?？疾焱聹?0添加次序?qū)θ橐毫降挠绊?，結(jié)果見圖9。

圖9 吐溫20添加次序?qū)θ橐毫降挠绊?/p>

由圖9可知，均質(zhì)前添加吐溫20，吐溫20添加量對(duì)新鮮乳液粒徑無顯著影響。而均質(zhì)后添加少量吐溫20就能使乳液粒徑顯著變小，吐溫20添加量超過0.15%后，再加大吐溫20添加量，粒徑無明顯變化。吐溫20在乳化過程中會(huì)和蛋白質(zhì)進(jìn)行界面競(jìng)爭吸附，如果制備O/W型乳液時(shí)在均質(zhì)前添加吐溫20，由于小分子表面活性劑的界面吸附速度快于蛋白質(zhì)分子，形成的吐溫20-蛋白質(zhì)復(fù)合界面膜近油相表面可能以吐溫20分子為主，而近水相表面則以蛋白質(zhì)分子為主。如果在均質(zhì)后添加吐溫20，乳化過程中只有蛋白質(zhì)分子參與界面膜的形成，隨著后期吐溫20分子的界面取代作用，形成的吐溫20-蛋白質(zhì)復(fù)合界面膜近水相表面可能會(huì)覆蓋大量的吐溫20分子。這些吐溫20分子有效降低了油滴之間界面蛋白的疏水相互作用，從而阻止了油滴的相互聚集。這可能是均質(zhì)后添加吐溫20使乳液粒徑顯著變小的主要原因。

圖10、圖11分別為均質(zhì)前后添加吐溫20的大豆蛋白乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性情況。

注：從左到右吐溫20添加量分別為0%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%。

圖10 均質(zhì)前添加吐溫20的乳液儲(chǔ)藏期情況

注：從左到右吐溫20添加量分別為0%、0.05%、0.15%、0.2%、1.0%。

圖11 均質(zhì)后添加吐溫20的乳液儲(chǔ)藏期情況

由圖10可知，均質(zhì)前不同吐溫20添加量樣品之間的短期乳化穩(wěn)定性差異較大，吐溫20低添加量下乳液穩(wěn)定性比吐溫20高添加量時(shí)好，吐溫20的存在顯著降低了乳液穩(wěn)定性。

由圖11可知：新鮮乳液均未出現(xiàn)分層情況；乳液放置4 h后開始分層；放置8 h后，有明顯分層，繼續(xù)放置至24 h，乳液基本無變化。由試驗(yàn)結(jié)果可知，均質(zhì)后無論添加吐溫20與否，乳液的短期儲(chǔ)藏穩(wěn)定性差異較小，各樣品分層都較快，這可能是因?yàn)橹苽淙橐簳r(shí)吐溫20未參與高壓均質(zhì)所致。

綜合以上結(jié)果可知，不論是均質(zhì)前還是均質(zhì)后添加吐溫20，大豆蛋白乳液的界面蛋白都會(huì)被部分取代，但是添加次序?qū)θ橐悍€(wěn)定性的影響顯著不同。推測(cè)其原因可能是：均質(zhì)前添加吐溫20，由于吐溫20分子在均質(zhì)時(shí)快速吸附到界面(蛋白質(zhì)吸附慢)，油滴界面膜很難擁有相對(duì)完整的蛋白質(zhì)吸附層，這將導(dǎo)致乳液快速發(fā)生分層(圖10)；均質(zhì)后添加吐溫20，吐溫20分子對(duì)油滴界面蛋白質(zhì)的取代是從界面膜近水相表面開始，雖然部分蛋白會(huì)被取代，但最終界面膜近油相表面仍可能保持相對(duì)完整的蛋白質(zhì)吸附層，乳液不至于很快失穩(wěn)分層(圖11)。Kaltsa等[19]研究了不同比例乳清蛋白(WPI)與吐溫20穩(wěn)定的O/W型乳液的相分離(均質(zhì)前添加)，發(fā)現(xiàn)兩周之內(nèi)，不同混合比例形成的乳液穩(wěn)定性都較好，吐溫20含量的高低并不影響乳液穩(wěn)定性。這與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異，原因可能與乳化劑種類及乳化方式不同有關(guān)。

2.6 大豆蛋白乳液的微觀結(jié)構(gòu)

FITC可與蛋白質(zhì)分子的游離氨基發(fā)生親核反應(yīng)，通過共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定顯綠色熒光的偶聯(lián)物[10]。用0.01%FITC分別染色均質(zhì)前吐溫20添加量為0%和1%的大豆蛋白乳液，其激光共聚焦圖片見圖12。

注：(a)為吐溫20添加量0%；(b)為吐溫20添加量1%。

圖12 大豆蛋白乳液的激光共聚焦圖片

由圖12可知，未加入吐溫20的大豆蛋白乳液油滴四周有明顯的光暈，說明油滴的界面層含有較多的蛋白質(zhì)。而加入1%吐溫20后，在相同染色條件下油滴四周幾乎看不到光暈，說明界面吸附蛋白含量較未加入吐溫20的樣品顯著減少，說明吐溫20能將部分蛋白從界面取代下來。

3 結(jié) 論

吐溫20添加量、乳液中NaCl強(qiáng)度及乳液體系的pH等均能影響界面蛋白的取代率，但吐溫20不能將大豆分離蛋白完全從界面取代，這可能與大豆蛋白具有較緊密的構(gòu)象有關(guān)。吐溫20添加次序?qū)缑娴鞍椎娜〈始叭橐悍€(wěn)定性的影響顯著不同。均質(zhì)后添加吐溫20，界面蛋白的最高取代率為48.87%，而均質(zhì)前添加吐溫20，界面蛋白的最高取代率為33.93%。在當(dāng)前大豆蛋白乳液制備條件下，均質(zhì)后添加吐溫20幾乎不影響乳液穩(wěn)定性，而均質(zhì)前添加吐溫20則隨著吐溫20添加量增加乳液失穩(wěn)更快。通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，加入吐溫20后的乳液界面吸附蛋白層明顯變薄。