毛洪博， 孟凡杰， 譚婷婷

(1.武漢科技大學(xué)天佑醫(yī)院檢驗(yàn)科， 湖北 武漢 430064 2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院檢驗(yàn)科， 山東 濰坊 262500)

自身免疫性疾病多由機(jī)體耐受遭到破壞后，免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞或效應(yīng)分子對(duì)固有的自身抗原產(chǎn)生病理性免疫應(yīng)答，從而攻擊正常的細(xì)胞、組織或器官所致[1]，通常認(rèn)為與女性、家族史、誘病環(huán)境暴露等因素密切相關(guān)[2]?；顒?dòng)期自身免疫性疾病患者可為初次發(fā)病或已病復(fù)發(fā)，需積極采取有效干預(yù)措施改善其預(yù)后，此階段其體內(nèi)炎癥反應(yīng)較為活躍，疾病臨床特征明顯，且外周血中可檢測(cè)出高效價(jià)自身抗體及自身反應(yīng)免疫細(xì)胞[3]。迄今為止，臨床已發(fā)現(xiàn)較多導(dǎo)致自身免疫性疾病的標(biāo)志抗體，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的抗雙鏈DNA抗體、抗小核糖核蛋白抗體[4]，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的抗絲聚蛋白抗體，干燥綜合征(SS)的抗SS抗原B抗體，已令臨床診治及病理研究工作受益頗多。然而近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)能廣泛參與細(xì)胞因子調(diào)控[5]，并因此影響自身免疫性疾病發(fā)展進(jìn)程，因此，有必要對(duì)其自身抗體在自身免疫性疾病中的表達(dá)情況作出分析，本研究取得一定成果，現(xiàn)作如下報(bào)道。

1 資料與方法

1.1一般資料:回顧性分析2016年7月至2019年6月期間，武漢科技大學(xué)天佑醫(yī)院收治的139例活動(dòng)期自身免疫性疾病患者臨床資料，納入標(biāo)準(zhǔn):①符合對(duì)應(yīng)自身免疫性疾病相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②根據(jù)疾病活動(dòng)度評(píng)分(DAS)確認(rèn)處于活動(dòng)期[7]；③年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并原發(fā)性腎病、急慢性感染性疾病或惡性腫瘤；②妊娠期婦女；③臨床資料不完整。其中男性32例，女性107例；年齡為23～87歲，平均(52.54±9.21)歲；SLE 61例、SS 42例、RA 23例、其他類型13例。并將46例同期入院體檢的健康人群作為對(duì)照(納入標(biāo)準(zhǔn):自發(fā)入院體檢且已完善血常規(guī)、血生化、尿便常規(guī)、腹部超聲等基本項(xiàng)目，基本體檢項(xiàng)目結(jié)果顯示不存在嚴(yán)重器質(zhì)性疾病；排除標(biāo)準(zhǔn):存在手術(shù)史，有糖尿病、甲狀腺疾病等慢性病史)，其中男性9例，女性37例；年齡為22～85歲，平均(52.05±8.94)歲。性別構(gòu)成、年齡與納入患者比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2檢測(cè)方法:常規(guī)采集受試者肘靜脈血3mL，低溫下靜置凝血反應(yīng)30min，與3500r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，提取上清保存于-80℃冰箱；檢測(cè)前將血清樣品統(tǒng)一取出置于4℃冰箱內(nèi)緩慢融化，參照相關(guān)文獻(xiàn)所得結(jié)論制備或選取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)所需試劑與材料[8]，取bGFG標(biāo)準(zhǔn)品，以pH為9.8的碳酸鹽緩沖液稀釋至50mg/mL，100μL/孔加入采用海門(mén)市三和華興實(shí)驗(yàn)玻璃儀器廠生產(chǎn)的96孔板(每個(gè)血清標(biāo)本平行設(shè)置3孔)，37℃培養(yǎng)箱溫育1h后，置入4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜；傾去液體后拍干，以pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)+2g/L白明膠+10g/L牛血清白蛋白(BSA)配制為封閉液，加入200μL/孔，37℃培養(yǎng)箱溫育1h；傾去封閉液后拍干，以含有0.05%吐溫-20的PBS作為洗滌液，洗滌3min×5次；加入被PBS(pH=7.4)以1:40稀釋的血清樣本100μL/孔作為一抗，37℃培養(yǎng)箱溫育1h；傾去液體后拍干，洗滌3min 7次，加入1:3×104稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白(Ig)G或羊抗人I gM作為二抗，37℃培養(yǎng)箱溫育1h；傾去液體后拍干，洗滌3min 7次，加入新配鄰苯二胺顯色液100μL/孔，顯色10min后加終止液，送入酶標(biāo)儀，在492nm波長(zhǎng)位置測(cè)定每孔吸光度，3孔平行數(shù)據(jù)取均值，以健康人群樣本吸光度平均值+2×標(biāo)準(zhǔn)差為陽(yáng)性界定值進(jìn)行滴度測(cè)算。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所得數(shù)據(jù)均錄入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，計(jì)量資料經(jīng)由Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢與Bartlett方差齊性檢驗(yàn)驗(yàn)，均已證實(shí)具備方差齊性且近似服從正態(tài)分布，因此以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同患病類型間比較采用單因素方差分析(one way-ANOVA)，對(duì)分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)逐一與對(duì)照樣本比較，不同腎損害情況間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)模型，選擇雙側(cè)顯著性檢驗(yàn)，返回相關(guān)系數(shù)(r)、置信區(qū)間(95%CI)及P值；預(yù)測(cè)效能評(píng)估采用受試者工作特征(ROC)曲線，獲取曲線下面積(AUC)、95%CI、敏感度、特異度、cut-off值等參數(shù)，均以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同患病類型患者血清自身抗體水平比較:活動(dòng)期SLE、SS、RA、其他類型自身免疫性疾病患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體水平均明顯高于健康人群，且RA患者明顯高于SLE患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同患病類型患者血清抗bFGF-IgG抗體 抗bFGF-IgM抗體水平比較

注:與健康人群比較，*P<0.05

2.2不同腎損害情況患者血清自身抗體及UAER水平比較:活動(dòng)期自身免疫性疾病腎損害患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體及UAER水平均明顯高于非腎損害患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同進(jìn)展階段患者血清抗bFGF-IgG抗體抗bFGF-IgM抗體及UAER水平比較

2.3相關(guān)性分析:Pearson相關(guān)系數(shù)模型顯示，活動(dòng)期自身免疫性疾病患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體水平與UAER水平均表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性(r>0，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 Pearson相關(guān)系數(shù)模型統(tǒng)計(jì)參數(shù)

2.4預(yù)測(cè)效能分析:血清抗bFGF-IgG抗體預(yù)測(cè)活動(dòng)期自身免疫性疾病患者腎損害的ROC曲線AUC為0.745(0.664～0.815)與抗bFGF-IgM抗體的0.712(0.629～0.785)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(DeLong Z=0.964，P=0.531)，預(yù)測(cè)敏感度分為別83.33%、91.67%，特異度分別為64.08%、61.17%，cut-off值分別為208.01×10-3、224.79×10-3，見(jiàn)圖1。

圖1 血清自身抗體預(yù)測(cè)腎損害的ROC曲線

3 討 論

自身免疫性疾病患者由于體內(nèi)存在豐富的免疫復(fù)合物及類風(fēng)濕因子，非特異性結(jié)合的能力相較于健康人群更高，因此通過(guò)間接法血清自身抗體檢測(cè)結(jié)果通常偏高，有必要建立試驗(yàn)體系進(jìn)行優(yōu)化，以提高檢測(cè)的精確性。既往研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)bFGF而言，其等電點(diǎn)在9.6左右，因此其包被條件需選取偏離該值且接近普通體系的溶液酸堿度，已證實(shí)在pH為9.8時(shí)可相較于9.2、10.0獲得更特異性反應(yīng)最強(qiáng)的試驗(yàn)結(jié)果，需注意確?？乖磻?yīng)達(dá)到飽和，如再增加bFGF濃度，則將提高空白孔背景信號(hào)。bFGF作為體內(nèi)分布廣泛的細(xì)胞因子，幾乎表達(dá)于所有來(lái)源于中胚層、神經(jīng)外胚層的組織中，尤其內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)活躍，由于在細(xì)胞外間質(zhì)能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，有一定幾率刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗體。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期SLE、SS、RA、其他類型自身免疫性疾病患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體水平均顯著較健康人群更高，且RA患者顯著較SLE患者更高，這說(shuō)明自身免疫性疾病患者體內(nèi)抗bFGF自身抗體表達(dá)相對(duì)活躍，該物質(zhì)可能參與疾病發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，其中RA患者表達(dá)尤為旺盛，究其原因可能與抗bFGF自身抗體加重軟骨損害有關(guān)。相關(guān)專家表示，RA患者產(chǎn)生膠原蛋白、纖絲蛋白相關(guān)自身抗體或磷脂抗體將特異性增強(qiáng)其脾臟、關(guān)節(jié)翳募集特異性T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，上調(diào)組織對(duì)細(xì)胞因子浸潤(rùn)的敏感性，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷程度增加。

既往臨床檢測(cè)多將bFGF作為腫瘤組織中，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)共同調(diào)控局部微血管形成，直接對(duì)其生物學(xué)行為及患者預(yù)后構(gòu)成顯著性影響。但近年來(lái)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，bFGF與Ⅰ型膠原表達(dá)增高是腎單位萎縮、消失及纖維組織增生面積擴(kuò)大的表現(xiàn)，可促進(jìn)細(xì)胞因子釋放，對(duì)細(xì)胞間相互作用及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生刺激，導(dǎo)致腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞過(guò)度激活、表型轉(zhuǎn)換并異常增生，檢測(cè)水平與病變程度存在明顯相關(guān)性，甚至更先于尿素氮、血肌酐、尿酸等常見(jiàn)腎功能指標(biāo)實(shí)現(xiàn)早期預(yù)測(cè)，對(duì)臨床盡早掌握慢性腎臟疾病患者進(jìn)行性纖維化導(dǎo)致腎功能衰竭的病程進(jìn)展有重要意義。本研究中，活動(dòng)期自身免疫性疾病腎損害患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體及UAER水平均顯著較非腎損害患者更高，且均與UAER表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性，其滴度水平分別≥208.01、224.79時(shí)，可高風(fēng)險(xiǎn)提示為自身免疫性疾病患者合并有腎損害，這說(shuō)明活動(dòng)期自身免疫性疾病患者發(fā)生腎損害過(guò)程與抗bFGF抗體密切相關(guān)，具體機(jī)制仍不十分明確，有待臨床進(jìn)一步深入探索。趙鳳芝等[9]認(rèn)為，運(yùn)用異常表達(dá)抗bFGF抗體情況，能監(jiān)測(cè)疾病發(fā)生情況，評(píng)估其與抗原中和、競(jìng)爭(zhēng)抑制細(xì)胞增殖等作用，可為腫瘤性疾病控制提供治療思路，盡管已有鼠抗人、兔抗人的多克隆或單克隆抗bFGF抗體上市，但其療效仍需要大量臨床研究加以證實(shí)。

綜上所述，抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體可能參與到各種活動(dòng)期自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展病理機(jī)制中，尤其與腎損害作用密切相關(guān)，臨床早期檢測(cè)可為預(yù)后評(píng)估及診治策略提供參考。