劉宏偉， 唐興國， 李斌斌， 孟令麗， 秦博文

(1.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院， 河北 承德 067000 2.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河北 唐山 063000)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種急性腦血管病，具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的健康和生存質(zhì)量[1]。腦出血主要損傷是由腦水腫、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等因素參與的繼發(fā)性腦組織損傷，炎性反應(yīng)在損傷中起關(guān)鍵作用，成為研究熱點(diǎn)[2]。白細(xì)胞分化抗原14(CD14)是脂多糖(LPS)受體，腦損傷后患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞CD14表達(dá)顯著增加。但CD14本身缺乏與細(xì)胞內(nèi)信號交流的跨膜區(qū)及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，因此需由其他跨膜蛋白進(jìn)行信號傳遞。TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的人類Toll樣受體，屬于跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，在機(jī)體炎癥及免疫反應(yīng)中起重要作用。有研究表明，在大鼠腦缺血再灌注模型中，TLR4信號途徑被激活，誘導(dǎo)大量炎性反應(yīng)發(fā)生，加重神經(jīng)元損傷，抑制TLR4能減少腦缺血再灌注損傷[3]。中醫(yī)藥對中風(fēng)的治療積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，參芍口服液可降低動脈粥樣硬化大鼠IL-8的表達(dá)，通過抑制炎癥因子的表達(dá)緩解組織炎癥。腦組織損傷中是否發(fā)揮抗炎作用及其作用機(jī)理尚未見報(bào)道，為此，本實(shí)驗(yàn)采用自體血法建立腦出血模型，選用CD14、TLR4、IL-8作為研究指標(biāo)，探索參芍口服液對腦出血后繼發(fā)性腦損傷的作用及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料:參芍口服液(10mL/支)，由唐山市工人醫(yī)院制劑室制備，批號:Z20050957；TLR4一抗、CD14一抗(武漢博士德生物公司)；IL-8一抗(美國Santa Cruz Bio公司)；SP系列免疫組化試劑盒(福建邁新試劑公司)；β-actin 單克隆抗體(美國Sigma公司)。清潔級SD雄性大鼠48只，8～12周齡，體重250±20g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司購買，分籠飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動物中心，室溫23～26℃，濕度40%～60%，飼養(yǎng)環(huán)境符合實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境設(shè)施要求，在籠中可自由攝食飲水。

1.2方 法

1.2.1動物分組與腦出血模型制備:實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(Sham)，腦出血模型組(ICH)，參芍口服液干預(yù)組(SS)。各組大鼠按不同時(shí)間點(diǎn)又分為6h，12h，24h，72h和7d五個小組。10%水合氯醛(0.03mL/kg)腹腔麻醉，微量注射器抽取新鮮股動脈血注射到腦基底節(jié)區(qū)；Sham組注射等量生理鹽水，余步驟與ICH組相同。SS組于術(shù)后2h大鼠完全蘇醒后參芍口服液8mL/d灌胃，分兩次給藥，各組到時(shí)間點(diǎn)處死動物。

1.2.2檢測指標(biāo)

1.2.2.1血腫周圍腦組織含水量測定:10%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速斷頭取腦組織，收集血腫周圍腦組織約120mg，電子天平稱濕重，隨后100℃恒溫箱烘烤約48h，稱干重。

1.2.2.2H-E染色觀察腦組織神經(jīng)元病理變化和計(jì)數(shù)未受損神經(jīng)元數(shù)量變化:選取腦組織血腫周圍各5張切片，每隔3張取1張，400倍鏡下取不同區(qū)域4個視野計(jì)數(shù)未受損神經(jīng)元陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.2.3SP法免疫組織化學(xué)染色及CD14、TLR4和IL-8陽性細(xì)胞計(jì)數(shù):SP法免疫組織化學(xué)染色，CD14、TLR4和IL-8陽性細(xì)胞結(jié)果評定:陽性細(xì)胞中出現(xiàn)棕色顆粒，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、定位明確、染色清晰。400倍鏡下每張切片隨機(jī)選6個具有代表性非相互重疊視野，分別計(jì)數(shù)CD14、TLR4和IL-8免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.2.4蛋白免疫印跡法測定CD14、TLR4和IL-8:收集基底節(jié)區(qū)周圍血腫新鮮腦組織，制備腦組織勻漿，提取腦組織總蛋白，根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品數(shù)量計(jì)算所需工作液，酶標(biāo)儀測定A562nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度。蛋白免疫印跡平均光密度OD值測定及結(jié)果判定:所測結(jié)果進(jìn)行半定量分析，將曝光的蛋白條帶用Image Lab凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶分析，得出光密度值，以目標(biāo)蛋白OD值/內(nèi)參OD值的比值來表示。

2 結(jié) 果

2.1腦組織含水量變化:與Sham組比較，ICH組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量均明顯升高(P<0.05)。6h小組后出現(xiàn)腦水腫，12h小組明顯，24h～72h達(dá)到高峰，隨后腦組織含水量出現(xiàn)下降趨勢，ICH 7d基本恢復(fù)正常。SS各小組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量較ICH各組明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腦組織含水量變化比較

注:a:與Sham組比，P<0.05；b:與ICH組比，P<0.05

2.2腦組織切片HE和尼氏染色結(jié)果觀察:腦組織切片HE染色結(jié)果:Sham組腦組織神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，胞核大、圓，胞質(zhì)嗜酸性；ICH 6h組血腫周圍腦組織水腫，神經(jīng)元腫脹；術(shù)后24～72h，血腫周圍組織高度水腫、壞死，細(xì)胞核皺縮濃染，胞漿淡染，部分神經(jīng)元水腫變性、壞死，并伴有出現(xiàn)大量紅細(xì)胞，炎細(xì)胞浸潤，神經(jīng)細(xì)胞疏松，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外間隙增大；腦出血后7d此現(xiàn)象基本消失。SS組腦組織神經(jīng)細(xì)胞腫脹緩解，細(xì)胞形態(tài)基本正常，病理改變減輕。(圖1)Sham組腦組織神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常，尼氏體較多。ICH 6h組尼氏體減少，腦組織輕度水腫；ICH 12h組神經(jīng)元尼氏體明顯減少，細(xì)胞間隙增寬，腦組織水腫明顯；ICH 72h組僅見少量正常的神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體皺縮，核碎裂，尼氏體消失，腦組織高度水腫、壞死。SS組核碎裂現(xiàn)象改善，受損神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，尼氏體減少程度減輕，細(xì)胞間隙變窄。(圖2)與Sham組相比，ICH后6h未受損神經(jīng)元減少，12h～72h明顯減少，72h達(dá)高峰，神經(jīng)元損傷最嚴(yán)重；與模型組相比，SS各小組未受損神經(jīng)元數(shù)均明顯增多(P<0.05)，見表2。

圖1 不同組大鼠腦出血血腫周圍腦組織神經(jīng)細(xì)胞變化 HE染色(×400)

2.3IL-8、CD14和TLR4蛋白免疫組化染色結(jié)果:Sham組，IL-8陽性細(xì)胞在腦組織中少量表達(dá)。ICH后6h局部少量表達(dá)，12h后隨時(shí)間延續(xù)，IL-8陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，著色逐漸變深，免疫反應(yīng)性增強(qiáng)(P<0.05)。ICH后72h時(shí)，腦組織血腫周圍IL-8陽性細(xì)胞大量分布，細(xì)胞皺縮濃染，IL-8蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，并見腦組織細(xì)胞間隙增寬。參芍口服液干預(yù)后IL-8陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P<0.05)。Sham組TLR4未見蛋白表達(dá)或僅有少量表達(dá)；ICH后血腫周圍TLR4陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加，6h組有所增加，12h增加明顯，72h達(dá)高峰，以后陽性表達(dá)呈下降趨勢，7d后表達(dá)相對最弱，但仍高于Sham組(P<0.05)；與ICH組相比，SS組TLR4陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。Sham組腦組織細(xì)胞偶有CD14表達(dá)；ICH組中CD14表達(dá)明顯增加(P<0.05)，可觀察到大量棕黃色深染陽性細(xì)胞；SS組較ICH組陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，見表3、圖3。

表2 大鼠血腫周圍未受損神經(jīng)元計(jì)數(shù)

注:a:與Sham 組比，P<0.05；b:與ICH組比，P<0.05

表3 各組大鼠血腫周圍IL-8 TLR4和CD14陽性細(xì)胞數(shù)量的變化

注:a:與Sham組比，P<0.05；b:與ICH組比，P<0.05

圖2 不同組大鼠腦出血血腫周圍尼氏染色結(jié)果觀察(×400)

2.3IL-8、CD14和TLR4蛋白免疫組化染色結(jié)果:Sham組，IL-8陽性細(xì)胞在腦組織中少量表達(dá)。ICH后6h局部少量表達(dá)，12h后隨時(shí)間延續(xù)，IL-8陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，著色逐漸變深，免疫反應(yīng)性增強(qiáng)(P<0.05)。ICH后72h時(shí)，腦組織血腫周圍IL-8陽性細(xì)胞大量分布，細(xì)胞皺縮濃染，IL-8蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，并見腦組織細(xì)胞間隙增寬。參芍口服液干預(yù)后IL-8陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P<0.05)。Sham組TLR4未見蛋白表達(dá)或僅有少量表達(dá)；ICH后血腫周圍TLR4陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加，6h組有所增加，12h增加明顯，72h達(dá)高峰，以后陽性表達(dá)呈下降趨勢，7d后表達(dá)相對最弱，但仍高于Sham組(P<0.05)；與ICH組相比，SS組TLR4陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。Sham組腦組織細(xì)胞偶有CD14表達(dá)；ICH組中CD14表達(dá)明顯增加(P<0.05)，可觀察到大量棕黃色深染陽性細(xì)胞；SS組較ICH組陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，見表3、圖3。

圖3 血腫周圍CD14、TLR4和IL-8免疫組化染色(×400)

2.4干預(yù)后各組IL-8、TLR4和CD14蛋白表達(dá)量:ICH組IL-8表達(dá)量較Sham組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ICH組相比SS組大鼠腦組織血腫周圍IL-8蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.05)。Sham組TLR4蛋白表達(dá)微弱，ICH組TLR4表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，與ICH組相比，SS組TLR4表達(dá)量減少明顯(P<0.05)。正常大鼠腦組織內(nèi)CD14蛋白少量表達(dá)，條帶著色淺；與Sham組相比，ICH組CD14表達(dá)顯著升高，蛋白條帶顯示深黑色；SS組較ICH組CD14蛋白條帶著色變淺，表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、表4。

圖4 各組大鼠腦組織IL-8、TLR4和CD14蛋白表達(dá)量

表4 各組大鼠腦組織IL-8 TLR4和CD14蛋白表達(dá)量

注:a:與Sham組比，P<0.05；b:與ICH組比，P<0.05

3 討 論

IL-8是一種多源性細(xì)胞因子，對炎性細(xì)胞均具有趨化作用，在炎癥過程中發(fā)揮重要作用。楊永青等[4]報(bào)道IL-8能召集白細(xì)胞聚集、促進(jìn)白細(xì)胞浸潤，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基及釋放大量細(xì)胞因子，損害腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生。蔣令修等[5]報(bào)道在腦缺血再灌注模型中，靜脈注射IL-8單克隆抗體，可明顯抑制白細(xì)胞的浸潤，減輕炎癥反應(yīng)，最終減少繼發(fā)性腦損傷。以上證據(jù)表明，IL-8可能參與介導(dǎo)了腦出血后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，并在腦神經(jīng)元損傷過程中起著重要作用。

CD14作為一種脂多糖(LPS)的高親和受體，能夠在脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)的協(xié)同作用下結(jié)合LPS，引起細(xì)胞活化，吞噬LPS及誘導(dǎo)炎癥因子(IL-8)的釋放過程，啟動炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致機(jī)體損傷[6]。腦組織損傷后引發(fā)白細(xì)胞浸潤，誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，這些白細(xì)胞表面表達(dá)的CD14在腦損傷后的局部炎癥免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用。張琦等[7]通過將尾動脈血注入大鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)制作腦出血模型，發(fā)現(xiàn)血腫周圍腦組織CD14mRNA表達(dá)增強(qiáng)，說明腦出血后存在某些因素誘發(fā)CD14高表達(dá)，提示CD14參與腦出血后的病理損傷過程。同時(shí)，CD14缺乏跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，不能單獨(dú)將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，需要其它蛋白協(xié)助完成[8]。CD14/TLR4信號通路能夠介導(dǎo)炎性因子表達(dá)，參與多種炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。

TLR4能夠特異識別非生物源性刺激，啟動和放大炎性級聯(lián)反應(yīng)[9]。陶蕾等[10]也證明了TLR4在外傷性腦損傷模型中表達(dá)增加，并誘導(dǎo)炎癥因子IL-8大量表達(dá)。這些證據(jù)說明，在腦出血模型中，CD14/TLR4可能參與調(diào)控炎癥因子IL-8的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)觀察了腦出血后IL-8和CD14、TLR4的表達(dá)關(guān)系，免疫組化結(jié)果顯示，腦出血后6h血腫周圍開始出現(xiàn)TLR4陽性細(xì)胞，與Sham組相比較陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)，隨時(shí)間延續(xù)，腦出血72h后陽性細(xì)胞數(shù)量最多(P<0.05)，之后有所下降。免疫蛋白印跡結(jié)果顯示，腦出血后6h血腫周圍CD14蛋白表達(dá)開始增加，12h增加更為明顯，隨時(shí)間推移，CD14表達(dá)逐漸增加，72h增加最為明顯，此后逐漸下降。IL-8、TLR4在免疫組化和免印跡檢測結(jié)果中表達(dá)變化與CD14趨勢一致。兩兩相關(guān)性分析，結(jié)果表明TLR4與CD14表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)；TLR4與IL-8表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)；IL-8表達(dá)水平與腦含水量呈正相關(guān)(P<0.05)。提示，大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血后，CD14/TLR4信號通路可能通過誘導(dǎo)IL-8表達(dá)加重血腫周圍腦組織的繼發(fā)性損傷。

有研究認(rèn)為，治療出血性中風(fēng)患者應(yīng)以活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)為基本原則。而參芍口服液的主要功效為活血化瘀，益氣通絡(luò)。本研究結(jié)果表明，CD14/TLR4能夠誘導(dǎo)腦出血模型IL-8炎性因子表達(dá)增加，導(dǎo)致腦組織的繼發(fā)性損傷，參芍口服液干預(yù)后，腦組織的含水量下降；腦組織神經(jīng)細(xì)胞腫脹明顯減輕，胞間間隙變窄，未受損神經(jīng)元數(shù)增加。免疫組化、免疫印跡結(jié)果顯示IL-8陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。IL-8表達(dá)量顯著降低，提示參芍口服液可通過CD14/TLR4信號通路減弱炎癥因子IL-8介導(dǎo)的炎癥損傷。