吳建安， 尚 廈， 胡 倩

(湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校， 湖北 荊州 434020)

口腔癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，在頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率僅次于鼻咽癌。在所有口腔癌患者中，口腔鱗狀癌(OSCC)是主要的組織病理學(xué)類型，超過90%[1]?？谇话┑陌l(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，例如吸煙、飲酒、病毒感染、營養(yǎng)不良和不良飲食習(xí)慣[2]。周期蛋白依賴性激酶4(CDK4) 的生成為細(xì)胞 G1期進(jìn)展所必需，并控制該期進(jìn)展速率的表達(dá)[3]。許多研究表明[4]，CDK4與口腔鱗狀癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中過度表達(dá)有關(guān)，口腔鱗狀癌組織中CDK4水平下降，與口腔癌患者的生存率和預(yù)后有關(guān)，這意味著CDK4表達(dá)水平是治療癌癥的理想靶點(diǎn)。因此，對CDK4表達(dá)水平有抑制的藥物可能是癌癥治療的一個(gè)強(qiáng)有力的治療選擇，包括口腔鱗狀癌。隨著癌癥治療聲音的不斷增加，抗癌藥物的研究已成為許多科學(xué)家的研究對象，胡桃醌存在于胡桃屬植物中，如核桃樹葉、樹皮、青果皮等。在中國民間流傳其可用于治療胃癌、肝癌、肺癌和其他類型的癌癥。據(jù)報(bào)道，胡桃醌可抑制大鼠中氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的腸癌發(fā)生，可能是人類腸道腫瘤中一種很有前途的化學(xué)預(yù)防劑。胡桃醌在最近的研究中也被證明對一些腫瘤細(xì)胞具有抗增殖和凋亡的活性，包括肉瘤腹水細(xì)胞、胃癌、結(jié)腸癌、表皮樣癌、白血病和前列腺癌[5]。然而，有關(guān)胡桃醌治療口腔癌的分子機(jī)制和化療潛力的研究卻很少。本研究以人口腔鱗癌細(xì)胞系Tca8113為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察胡桃醌的抗增殖作用和凋亡誘導(dǎo)活性，并對其可能的分子機(jī)制進(jìn)行了闡述，特別是CDK4表達(dá)水平的研究。本研究將為進(jìn)一步了解胡桃醌在口腔鱗癌防治中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞系:人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，批號20180113。

1.1.2主要試劑與儀器:胡桃醌購自上海友思生物技術(shù)有限公司，批號20171127；DMEM培養(yǎng)基購自瑞士Lonza公司，批號AH0478；胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素購自美國Gibco公司，批號CK1357、CK3619；流式細(xì)胞儀凋亡檢測試劑盒和兔抗人CDK4多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號20171209、20180207；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞礬(DMSO)購自美國Sigma公司，批號ab0617、ab0729；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司；Nunc細(xì)胞培養(yǎng)板為美國Gibco公司；EVOS M5000倒置顯微鏡為日本奧林巴斯公司；K3酶標(biāo)儀為奧地利Tecan公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):將人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞維持在含有10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。在37℃和5%CO2中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的形狀和數(shù)量、培養(yǎng)液的顏色和透明度，每3天更換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%以上時(shí)，采用0.5%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。當(dāng)體積減小時(shí)，用含10%犢牛血清的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹入單細(xì)胞懸浮液。在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2胡桃醌培養(yǎng)液的配置以及實(shí)驗(yàn)分組:首先將胡桃醌以1mmoL/L的濃度溶解于新制備的培養(yǎng)基中形成母液，然后過濾滅菌，然后稀釋，制備濃度為25μmoL/L、50μmoL/L、100μmoL/L的試驗(yàn)溶液。將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為對照組(0μmoL/L)、胡桃醌低劑量組(25μmoL/L)、胡桃醌中劑量組(50μmoL/L)、胡桃醌高劑量(100μmoL/L)，實(shí)驗(yàn)組用相應(yīng)濃度的胡桃醌培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，對照組用等體積的DSMO培養(yǎng)。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣，培養(yǎng)24h。

1.2.3胡桃醌作用后Tca8113細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察:通過用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞制備細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞懸浮液加入到6孔板的每個(gè)孔中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的胡桃醌溶液，對照組加相同體積的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h之后，取出6孔板以在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長形態(tài)并拍照。

1.2.4MTT法檢測Tca8113細(xì)胞增殖情況:將對數(shù)生長期Tca8113細(xì)胞用胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔120μL。細(xì)胞貼壁后，分別加入已配制的不同濃度的胡桃醌溶液，使其濃度分別為0、25、50、100μmoL/L，每種藥物濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)制孔。以0μmoL/L胡桃醌為對照組。培養(yǎng)24h后，將濃度為5g/L的MTT(20μl)添加到每個(gè)孔中。在黑暗中孵育4h，丟棄上清液，向每個(gè)孔中加入DMSO(150μl)，振蕩10min，直至紫色浮渣完全溶解，用酶標(biāo)儀測量490nm處的吸光度(OD)值。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測Tca8113細(xì)胞的凋亡率:收集各處理組培養(yǎng)24h的細(xì)胞，通過胰蛋白酶消化后制備成細(xì)胞懸浮液，并用PBS洗滌兩次，將細(xì)胞在4℃下70%乙醇中固定過夜，隨后加入含RNA酶的PI染液染色30min，最后上機(jī)檢測，并用配套軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.2.6細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測CDK4的表達(dá):將高壓消毒的蓋玻片逐個(gè)放入孔培養(yǎng)板內(nèi)，將經(jīng)胰酶消化制成懸液的細(xì)胞接種到底部鋪有蓋玻片的培養(yǎng)板內(nèi)，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的胡桃醌溶液，孵育24h后用70%乙醇固定，取出蓋玻片，將細(xì)胞面朝上，快速取出并轉(zhuǎn)移到PBS緩沖液中洗滌3次，嚴(yán)格按照通用型SP試劑盒說明書操作，完成CDK4的細(xì)胞免疫化學(xué)染色。染色后在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，得出陽性細(xì)胞率，用PBS代替一抗做陰性對照，以確定染色特異性。

2 結(jié) 果

2.1Tca8113細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察:在倒置顯微鏡下，對照組細(xì)胞可見其貼壁生長良好，細(xì)胞形態(tài)呈紡錘形或多角形，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。加入胡桃醌溶液后，隨著胡桃醌濃度的增加，可見細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞質(zhì)粗糙，顆粒積聚在其中，細(xì)胞變得更小和圓潤，失去附著力并從附著物上脫落。胡桃醌濃度越高，變化越明顯。見圖1。

圖1 各組Tca8113細(xì)胞形態(tài)學(xué)的比較(HE染色，×400)

2.2胡桃醌對人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞增殖的影響:胡桃醌對Tca8113細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且與濃度有關(guān)。胡桃醌低、中、高劑量組Tca8113細(xì)胞OD值均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.894、6.352、7.741，均P<0.05)；胡桃醌中、高劑量組Tca8113細(xì)胞OD值低于胡桃醌低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.975、6.136，均P<0.05),見表1。

表1 胡桃醌對Tca8113細(xì)胞增殖抑制的影響

注:與對照組比較，aP<0.05；與胡桃醌低劑量組比較，bP<0.05

2.3流式細(xì)胞儀測定Tca8113細(xì)胞的凋亡率:胡桃醌高、中、低劑量組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.427、14.032、21.553，均P<0.05)；胡桃醌高、中劑量組細(xì)胞凋亡率高于胡桃醌低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.642、15.085，均P<0.05)；胡桃醌高劑量組高于胡桃醌中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.261，P<0.05),見表2。

2.4胡桃醌對CDK4表達(dá)的影響:胡桃醌高、中、低劑量組CDK4陽性率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.586、17.375、24.462，均P<0.05)；胡桃醌高、中劑量組CDK4陽性率低于胡桃醌低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.789、16.876，均P<0.05)；胡桃醌高劑量組CDK4陽性率低于胡桃醌中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.089，P<0.05),見表3。

表2 不同濃度胡桃醌對Tca8113細(xì)胞凋亡率的影響

注:與對照組比較，aP<0.05；與胡桃醌低劑量組比較，bP<0.05；與胡桃醌中劑量組比較，cP<0.05

表3 胡桃醌對Tca8113細(xì)胞CDK4表達(dá)陽性率的影響

注:與對照組比較，aP<0.05；與胡桃醌低劑量組比較，bP<0.05；與胡桃醌中劑量組比較，cP<0.05

3 討 論

口腔鱗癌是一種侵襲上皮的惡性腫瘤，是當(dāng)今世界上第六大最常見的腫瘤，盡管口腔鱗癌的診斷和綜合治療取得了進(jìn)展，但在過去的二十年內(nèi)，其5年生存率仍只有60%[6,7]。另外，由于面部變形和功能障礙，手術(shù)后患者的生活質(zhì)量較差，迫切需要新的有效的預(yù)防和治療口腔鱗癌的藥物。

近年來的研究表明[8,9]，醌在自然界中廣泛分布，具有許多生物學(xué)功能，可做抗菌劑、殺菌劑、抗瘧藥和抗癌藥，醌的生物效應(yīng)很大程度上是通過氧化還原活性形成活性氧以及游離硫醇共價(jià)修飾形成硫醚來實(shí)現(xiàn)的。胡桃醌是一種強(qiáng)效細(xì)胞毒劑，其細(xì)胞毒性基于其與氧的高反應(yīng)性，并且經(jīng)常用作自由基增強(qiáng)劑。Song[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胡桃醌在各種腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止和凋亡，但對人頭頸癌生長的影響的研究很少。因此，本研究調(diào)查了胡桃醌對人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞生長的影響，以進(jìn)一步闡述其抑制增殖途徑。本研究我們采用MTT法來定量檢測胡桃醌對Tca8113細(xì)胞的增值抑制作用，結(jié)果表明，胡桃醌能有效抑制Tca8113細(xì)胞的增殖活性，且隨著濃度的增加，抑制增殖作用越明顯。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度胡桃醌均有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，濃度越高，作用越強(qiáng)，說明胡桃醌可以誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞的凋亡。兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均清楚地表明胡桃醌對Tca8113細(xì)胞生長的影響，表明胡桃醌可能是潛在的口腔鱗癌預(yù)防和治療藥物。

有報(bào)道[11～13]指出某些抑癌基因和癌基因在口腔癌的發(fā)展中出現(xiàn)了異常表達(dá)，其中最突出的兩個(gè)基因是視網(wǎng)膜母細(xì)胞基因和p53基因，其中包括CDK4在內(nèi)的幾種視網(wǎng)膜母細(xì)胞基可以調(diào)控不同細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換。而細(xì)胞循環(huán)周期失控可導(dǎo)致異常的細(xì)胞增殖和腫瘤形成，有研究發(fā)現(xiàn)CDK4在舌癌中的陽性表達(dá)率為61.5%，顯著高于正常舌粘膜[14]，提示了CDK4與舌癌的增殖密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)測定不同濃度胡桃醌作用下Tca8113細(xì)胞中CDK4的陽性表達(dá)率，對胡桃醌的促凋亡機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步觀察，結(jié)果顯示胡桃醌有下調(diào)CDK4表達(dá)的作用，且胡桃醌濃度越高，對CDK4陽性表達(dá)率下調(diào)的作用越顯著，說明胡桃醌可能是通過調(diào)控CDK4的表達(dá)從而起到調(diào)控Tca8113細(xì)胞增殖和凋亡作用。

綜上所述，胡桃醌可抑制口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)CDK4的陽性表達(dá)率，抑制腫瘤的侵襲，提示胡桃醌在預(yù)防和治療口腔鱗癌方面具有潛在的臨床研究價(jià)值。