胡 煜, 周孟君, 李 剛, 劉 斌, 余 靜

(1.四川省綿陽市中心醫(yī)院兒科， 四川 綿陽 621000 2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科, 四川 瀘州 646000)

先天性心臟病(CHD)是小兒常見心血管疾患，左向右分流型CHD多并發(fā)肺動脈高壓(PAH)，若進展為Eisenmenger綜合征則失去治療機會。肺血管重構(gòu)是梗阻性PAH的病理學特征，其中包括肺動脈平滑肌細胞(PASMC)的生物學行為改變，如細胞外基質(zhì)沉積。PASMC功能受多種細胞因子調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓動物模型中結(jié)締組織生長因子(CTGF)基因和蛋白表達明顯增，且CTGF可促進PASMC膠原蛋白分泌，故推測CTGF與PASMC還有更廣泛的聯(lián)系。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)和三磷酸肌醇激酶(PI3K/PKB)通路參與多種細胞的增殖遷移 ，故推測PASMC的增殖遷移也可能經(jīng)這兩條通路[1]。PD98059和LY294002分別為ERK1/2和PI3K通路阻斷劑，本課題以大鼠PASMC為對象，研究上述兩種阻斷劑能否抑制CTGF刺激下的PASMC增殖遷移。

1 材料與方法

1.1PASMC培養(yǎng)和鑒定:6-8周齡SD大鼠，斷頸處死后取肺動脈血管中層肌性組織，眼科剪將其分離為1-2mm3大小塊狀物后接種培養(yǎng)瓶(1～2塊/cm2)，靜置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱貼壁2h后取出培養(yǎng)瓶，緩慢加入M199培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)7-10d可見細胞從組織塊邊緣長出，待其覆蓋瓶底面積70-80%后傳代至第3代做細胞爬片，免疫組化檢測a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)陽性可鑒定為PASMC。將PASMC分為空白組、CTGF組、CP組(CTGF+PD98059)、CL組(CTGF+LY294002)、CPL組(CTGF+PD98059+LY294002)，分別加入含相應(yīng)試劑的M199培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)。(試劑濃度:CTGF:50ng/mL,PD98059:20μmoL/L,LY294002:10μmoL/L)

1.2方 法

1.2.1PASMC增殖檢測:接種3-5代細胞于96孔板，每孔5×103個，貼壁過夜，棄原液后按分組加入培養(yǎng)基各100ul，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h后用WST-1細胞增殖檢測試劑孵育4h后酶標儀測各孔吸光值(OD值)，每組5個復孔，繪制細胞生長曲線。

1.2.2PASMC遷移檢測:Transwell接種細胞于Transwell(8um)小室，1×105個/室，放入24孔板內(nèi)(事先按分組加入培養(yǎng)基各800ul)，37℃、5% CO2培養(yǎng)分別培養(yǎng)6h、12h后，棉球輕輕抹去小室濾膜上層細胞，甲醇固定濾膜5min，考馬斯亮藍染色15min，400倍光鏡下計數(shù)上下左右中5個視野穿膜細胞，每組5個復孔。細胞劃痕:將Culture Insert(培養(yǎng)插件)置于6孔板，于培養(yǎng)插件每孔中加入70ul細胞懸液(3×105個/mL)，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h細胞貼壁后移除培養(yǎng)插件(每孔可見500um寬度劃痕)，按分組加入培養(yǎng)基各3mL，繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h后觀察劃痕寬度，Wimasis軟件分析實驗圖片。細胞骨架:將玻片置于6孔板，每孔接種細胞3×105個，37℃、5% CO2培養(yǎng)24h后細胞爬滿玻片，棄原培養(yǎng)液，按分組加入干預試劑各3mL，繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h后取玻片甲醇固定5min，考馬斯亮藍染色15min，鏡檢觀察細胞骨架。

1.3統(tǒng)計學處理:計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較用LSD-t法，用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1PASMC培養(yǎng)和鑒定:顯微鏡下觀察到細胞從組織塊邊緣長出(圖1)，形態(tài)呈長梭形，細胞基質(zhì)均勻分布，細胞核位于細胞中央，呈桿狀或橢圓形，可多個核仁。細胞平行生長，細胞連接緊密，間隙小，因細胞穩(wěn)定的增殖周期而使其呈“波谷狀”生長方式排列(圖2)，α-SMA免疫組化染色為鑒定金標準，如>95%細胞染色為陽性則為PASMC(圖3)。

2.2細胞增殖:WST-1法測OD值描繪細胞增殖曲線。相比空白組，CTGF刺激PASMC24、48、72、96和120h后增殖水平升高(P均<0.05)；相比CTGF組，CP、CL和CPL組PASMC在干預24、48、72、96和120h后增殖水平有不同程度下降，其中CPL組下降最顯著(P均<0.05)，見表1，圖4。

2.3細胞遷移:各組Transwell小室均可觀察到穿膜細胞，干預6h和12h后各組細胞計數(shù)的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相比空白組，CTGF組細胞穿膜數(shù)量增加(P<0.05)；相比CTGF組，CP、CL和CPL組細胞穿膜數(shù)量減少，CPL組減少最顯著(P均<0.05)，見表2，圖5。細胞劃痕示干預12h和24h后各組劃痕寬度計數(shù)的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相比空白組，CTGF組細胞劃痕寬度減小(P<0.05)；相比CTGF組，CP、CL和CPL組細胞劃痕寬度有不同程度增加，CPL組增加顯著(P均<0.05)，見表3，圖6。細胞骨架染色示干預12h后可見CTGF組細胞骨架模糊不清，其余各組清晰可見,且CP、CL和CPL組更加清晰；干預24h觀察所見各組細胞骨架清晰度與12h無明顯差異。見圖7。

表1 WST-1檢測OD值

注:1)與空白組比較，P<0.05；2)與CTGF組比較，P<0.05

表2 Transwell測PASMC透膜數(shù)

注:1)與空白組比較，P<0.05；2)與CTGF組比較，P<0.05

表3 Culture Insert測PASMC劃痕寬度

注:1)與空白組比較，P<0.05；2)與CTGF組比較，P<0.05

圖1 PASMC原代培養(yǎng) ×100倍

圖2 PASMC傳代培養(yǎng) ×200倍

圖3 PASMC α-SMA免疫組化染色×200倍

圖4 PASMC增殖趨勢圖

圖5 Transwell檢測細胞遷移(×400倍)

圖6 細胞劃痕檢測細胞遷移(×100倍)

圖7 考馬斯亮藍檢測細胞骨架(×400倍)

3 討 論

左向右分流型CHD常并發(fā)PAH和進行性右心衰竭，充血性PAH可導致肺組織結(jié)構(gòu)改變包括肺血管收縮、重構(gòu)和血栓形成而出現(xiàn)梗阻性PAH ，最終導致Eisenmenger綜合征。肺血管重構(gòu)是PAH的病理特征，在肺血管重構(gòu)中存在血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和肺動脈平滑肌細胞(PASMC)增殖遷移等現(xiàn)象，表現(xiàn)為肺小動脈中膜增厚、新生肺小血管形成和非肌性小動脈肌化等。PASMC常隨新生肺小血管中成纖維細胞增殖而分裂，并在增殖遷移過程中伴隨細胞外基質(zhì)蛋白(如膠原蛋白、纖維連接蛋白等)沉積從而導致肺血管重構(gòu)、肺組織纖維化及順應(yīng)性降低。

多種因素與PASMC增殖遷移有關(guān)，如低氧、PDGF、VEGF和CTGF等[2,3]。CTGF是富含半胱氨酸的分泌肽，由血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、神經(jīng)細胞和平滑肌細胞合成分泌，它與心臟、血管、腎臟、肺及肝臟等組織器官纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Bradley A等通過建立大鼠PAH模型，觀察到肺小動脈有內(nèi)膜膠原沉積并伴有內(nèi)皮功能障礙，肺血管內(nèi)PASMC增多，肺小動脈CTGF水平升高[4]。本實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，CTGF刺激下的PASMC增殖速度增快，Transwell穿模細胞數(shù)目增加，細胞劃痕融合速度加快并在24h內(nèi)基本消失，細胞骨架模糊不清，說明細胞增殖遷移現(xiàn)象較顯著。細胞增殖速度加快與細胞周期縮短有關(guān)，而細胞遷移則為增殖提供了空間，細胞遷移是細胞增殖、ECM和細胞骨架變化共同作用的結(jié)果。CTGF能增加PDGF-BB、TGF-β和IGF的作用，在體內(nèi)PDGF-BB和IGF均可刺激細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下血管平滑肌細胞中CTGF表達增加并能提高的增殖和遷移率，而抗CTGF抗體可阻止這一現(xiàn)象。另有研究表明[5]，TGF-β誘導的細胞遷移可由CTGF可介導，TGF-β除直接影響心臟修復細胞外還可能通過誘導下游效應(yīng)物的表達而發(fā)揮作用，如基質(zhì)細胞蛋白CTGF或內(nèi)皮素(ET-1),以上研究提示CTGF與PASMC增殖遷移有關(guān)。

CTGF是一種36～38 kDa的富含半胱氨酸的分泌蛋白，其促進細胞增殖遷移的機制尚不清楚，推測CTGF可能是某些整合素復合體的配體[6]。研究發(fā)現(xiàn)貓腎臟近端小管細胞的磷脂酸受體和Gαq蛋白可以Rho/Rho-激酶和αvβ6整合素依賴的方式激活潛在的TGF-β并促進PDGF-B和CTGF的產(chǎn)生和分泌，CTGF介導肝星狀細胞基質(zhì)沉積及肝纖維化過程中整合素αvβ1 siRNAs表達增加[6]，也可通過αvβ3整合素誘導少突膠質(zhì)細胞前體細胞增殖，本課題前期研究發(fā)現(xiàn)整合素β1和β3信號途徑能介導CTGF誘導的PASMC增殖遷移和細胞外基質(zhì)基因的表達，故推測CTGF可能與細胞表面的整合素受體結(jié)合產(chǎn)生第二信使經(jīng)信號轉(zhuǎn)導通路啟動下游基因表達，從而通過增加DNA合成、改變細胞周期和骨架蛋白合成等方式來促進細胞增殖遷移。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑，在基因表達調(diào)控和細胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PD98059是非ATP競爭性絲裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制劑，能特異地抑制MEK-1-介導的MAPK活化，抑制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化，并下調(diào)細胞周期蛋白E/Cdk2和D1/Cdk4水平，導致細胞阻斷在G1期。三磷酸肌醇激酶(PI3K/PKB)通路是許多細胞因子的下游信號傳導通路，通過調(diào)節(jié)細胞周期G2/M期抑制細胞凋亡，調(diào)控細胞RNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成，促進細胞增殖遷移和血管生成[7]。LY294002可以通透細胞，特異性抑制PI3K并抑制PI3K/Akt信號途徑。本研究觀察到PASMC在PD98059和/或LY294002干預下增殖速度較CTGF刺激組減慢，且抑制程度隨著干預濃度增加，Transwell穿模細胞數(shù)減少，細胞劃痕寬度減小速度變緩，細胞骨架解聚和重構(gòu)的現(xiàn)象不明顯，細胞骨架清晰。另有研究發(fā)現(xiàn)[8,9]，PD98059能抑制人皮膚成纖維細胞CTGF的表達，LY294002可通過抑制PI3K信號通路而減少腫瘤組織中血管內(nèi)皮細胞CTGF蛋白表達，并可協(xié)同其他化療藥物抑制CTGF對腫瘤生長的促進作用。這些研究提示CTGF促進PASMC增殖遷移過程可能經(jīng)過ERK1/2和PI3K/PKB信號通路。

本研究發(fā)現(xiàn)PAH肺血管重構(gòu)因素復雜，CTGF可能通過刺激PASMC增殖遷移的方式加重肺血管重構(gòu)。PASMC增殖遷移過程可被PD98059和/或LY294002抑制，提示它們所阻斷的ERK1/2和PI3K通路可能參與了CTGF刺激下的PASMC增殖遷移，并可能是阻斷或減輕肺血管重構(gòu)的新靶點。