王云朋, 劉章心怡, 張榮花, 趙 鵬, 章廣玲, 劉志勇

(1.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院， 河北 唐山 063000 2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院， 湖南 長沙 410013 3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河北 唐山 063000)

肺癌是對(duì)人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一。肺癌的病死率在許多發(fā)達(dá)國家以及我國許多大中城市已躍居常見腫瘤之首，占全部惡性腫瘤死亡的22.7%。miRNA影響腫瘤發(fā)生與發(fā)展的病理學(xué)機(jī)制已經(jīng)很清晰，即其可在腫瘤發(fā)生與發(fā)展的過程中表現(xiàn)為抑癌基因或癌基因，而這有賴于其所調(diào)控的靶基因的生物學(xué)功能。關(guān)于miR-663在腫瘤中的研究主要側(cè)重于其對(duì)于細(xì)胞生長，增殖，凋亡等的研究，而且主要是在鼻咽癌和胃癌細(xì)胞中進(jìn)行的[1]。此外，miR-663還被認(rèn)為是繼miR-155之后的又一個(gè)聯(lián)系炎癥與腫瘤的橋梁miRNA分子[2]。本研究小組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，miR-663可以通過抑制TGFB1的表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的增殖,因此，我們推測miR-663也可能影響肺癌細(xì)胞的惡性表型，如遷移和侵襲能力。本研究旨在利用轉(zhuǎn)移能力不同的人肺巨細(xì)胞癌的低轉(zhuǎn)移亞系PG-LH7和高轉(zhuǎn)移亞系PG-BE1，探討miR-663在PG-LH7細(xì)胞和PG-BE1細(xì)胞中的表達(dá)水平及對(duì)人肺癌細(xì)胞侵襲行為的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:A549由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供，PG-LH7和PG-BE1購自上海復(fù)祥生物。

1.2試劑和儀器:Lipofetamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，CCK-8試劑盒，購自日本同仁公司，transwell小室(8μm孔徑聚碳酸酯膜)和Matrigel購自美國Corning Costar公司，miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱和1300 SERIES A2超凈工作臺(tái)購自美國thermo公司，SpectraMax190全波長讀數(shù)儀購自美國Molecular Devices公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Mastercycler ep Realplex4購自德國Eppendorf公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng):A549細(xì)胞在10%FBS、100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI1640，PG-LH7和PG-BE1細(xì)胞系在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃含5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3.3CCK8實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分組，PG-LH7細(xì)胞:miR-663mimics組、control mimics組；PG-BE1細(xì)胞:miR-663 ASO組、ASO-NC組。用CCK8試劑盒檢測miR-663對(duì)對(duì)PG-LH7和PG-BE1細(xì)胞增殖的影響，將兩種細(xì)胞分別接種于96孔板，每組三個(gè)復(fù)孔，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組重復(fù)三次，分別于24h，48h和72h加CCK8試劑10ul/孔，孵育3h后用酶標(biāo)儀測定波長為450nm的吸光度值(即OD值)。

1.3.4軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn):5×103細(xì)胞混合在2×1640的1%瓊脂中，接種于6cm直徑的平皿中，每組三個(gè)復(fù)孔，并于37℃孵育。接中后第9天，計(jì)數(shù)大于50ge細(xì)胞的細(xì)胞克隆的個(gè)數(shù)。

1.3.5Transwell小室系統(tǒng)檢測細(xì)胞遷移侵襲:Transwell小室中進(jìn)行，在上室面鋪Matrigel膠。實(shí)驗(yàn)分組，PG-LH7細(xì)胞:miR-663mimics組、control mimics組；PG-BE1細(xì)胞:miR-663 ASO組、ASO-NC組。在Matrigel上室面接種5×104個(gè)細(xì)胞/100uL，下室加入含10%血清的完全培養(yǎng)基。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后，擦掉上室的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定30min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)不重復(fù)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)。Transwell小室的聚碳酸酯膜上不鋪Matrigel膠。

2 結(jié) 果

2.1miR-663在不同肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平:miR-663在PG-LH7細(xì)胞中的表達(dá)低于A549細(xì)胞中的表達(dá)水平(P<0.05),miR-663在PG-BE1細(xì)胞中的表達(dá)高于A549細(xì)胞中的表達(dá)水平(P<0.05),見表1。

表1 miR-663在A549 PG-LH7和PG-BE1細(xì)胞系中的表達(dá)水平

注:與A549 細(xì)胞組相比, #P<0.05; 與A549 細(xì)胞組相比, *P<0.05

2.2miR-663ASO對(duì)PG-BE1細(xì)胞中miR-663水平的影響:miR-663 ASO實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組PG-BE1細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平明顯降低，與control ASO對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3miR-663mimics對(duì)PG-LH7細(xì)胞中miR-663水平的影響:miR-663mimics實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組PG-LH7細(xì)胞中miR-663表達(dá)水平明顯增高，與control mimics對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 miR-663ASO對(duì)PG-BE1細(xì)胞中miR-663水平的影響

表3 miR-663 mimics對(duì)PG-LH7細(xì)胞中miR-663mRNA水平的影響

表4 miR-663對(duì)PG-LH7細(xì)胞和PG-BE1細(xì)胞細(xì)胞克隆形成的影響

注:PG-LH7細(xì)胞中與對(duì)照mimics組相比，*P<0.05；PG-BE1細(xì)胞中與對(duì)照mimics組相比，#P<0.05

2.4miR-663對(duì)PG-LH7細(xì)胞和PG-BE1細(xì)胞增殖的影響:軟瓊脂克隆形成(表4)及生長曲線實(shí)驗(yàn)(表5)，miR-663的高表達(dá)能夠有效的促進(jìn)PG-LH7細(xì)胞的增殖(P<0.05)。CCK8實(shí)驗(yàn)表明miR-663可以促進(jìn)PG-LH7細(xì)胞的增殖，如圖1A。

2.5miR-663對(duì)PG-LH7細(xì)胞和PG-BE1細(xì)胞侵襲遷移能力的影響:PG-LH7細(xì)胞中，miR-663組的侵襲遷移能力明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，PG-BE1細(xì)胞中，miR-663ASO組的侵襲遷移能力明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，見表6。

表5 miR-663對(duì)PG-LH7細(xì)胞和PG-BE1細(xì)胞生長的影響

表6 miR-663對(duì)PG-LH7細(xì)胞和PG-BE1細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

注: 與對(duì)照組相比,#P<0.01；與對(duì)照組相比,*P<0.01

圖1 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測miR-663對(duì)PG-LH7細(xì)胞和PG-BE1細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

MiRNA是真核生物中一大類長度約22nt的非編碼單鏈RNA分子，具有高度保守性。研究已經(jīng)證實(shí)，同一個(gè)miRNA可能調(diào)控多個(gè)靶基因，而同一個(gè)靶基因也可能受到多種miRNA的調(diào)控[3]。miRNA分子參與了細(xì)胞的生長，發(fā)育及分化各個(gè)方面[4]。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA分子可以調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的表達(dá)，miRNA在炎癥相關(guān)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程當(dāng)中亦發(fā)揮重要作用[5,6]。miR-663還被認(rèn)為是繼miR-155之后的又一個(gè)聯(lián)系炎癥與腫瘤的橋梁miRNA分子，可以通過靶定eEF1A2抑制胰腺癌細(xì)胞的生長和侵襲[7]。因此，我們推測miR-663也可能影響肺癌細(xì)胞的其他惡性表型，如遷移和侵襲能力。

miR-663可以通過抑制TGFB1的表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的增殖。選取人肺腺癌細(xì)胞A549以及人肺巨細(xì)胞癌的低轉(zhuǎn)移亞系PG-LH7和高轉(zhuǎn)移亞系PG-BE1為研究模型，本文研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移能力不同的人肺巨細(xì)胞癌的低轉(zhuǎn)移亞系PG-LH7和高轉(zhuǎn)移亞系PG-BE1兩種細(xì)胞中miR-663的表達(dá)確實(shí)存在明顯的差異。深入分析miR-663對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果提示miR-663調(diào)控了低轉(zhuǎn)移亞系PG-LH7和高轉(zhuǎn)移亞系PG-BE1細(xì)胞的侵襲遷移能力，但其具體的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。通過該項(xiàng)研究，為肺癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制提供了研究線索，并為肺癌的診斷和治療提供新的治療靶標(biāo)。