王慶國，王 璇，徐欣欣，陶 寧，劉 佩

（山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院/山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東泰安271018）

0 引言

‘黃冠’梨果實皮薄、果肉潔白、質(zhì)地細膩、石細胞少、汁液多、酸甜可口，且結(jié)果早、適應(yīng)性強，目前在中國華北、西北及長江中下游地區(qū)廣泛種植，具有較大的經(jīng)濟效益[1-2]?！S冠’梨果實常溫下極易軟化，采后通常需要低溫貯藏，由于低溫下冷害的影響，‘黃冠’梨果皮容易產(chǎn)生果面褐斑，大大降低商品價值[3]。低溫脅迫往往會誘導(dǎo)果實內(nèi)活性氧大量積累，而過多的活性氧物質(zhì)可造成膜脂過氧化，破壞膜系統(tǒng)；低溫貯藏期間‘黃冠’梨果皮褐變的發(fā)生往往與細胞膜損傷及酚類物質(zhì)代謝密切相關(guān)，因此提高低溫貯藏條件下果實細胞膜穩(wěn)定性、氧化防護體系等可控制果皮褐變的發(fā)生[4-6]。

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)是茉莉酸的類似物，廣泛存在于高等植物體內(nèi)，是一種天然的植物生長調(diào)節(jié)因子，在植物生長發(fā)育、抗逆反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7]。MeJA 可以調(diào)控植物的抗冷反應(yīng)，外源噴施MeJA能夠顯著提高水稻、小麥等植株冷脅迫下的抗性[8-9]；作為抗氧化增效劑，MeJA可通過調(diào)控酚類成分的合成與代謝有效提高植物生物活性、延長果蔬保質(zhì)期和提高植物抗冷能力[10]。近年來在采后果蔬保鮮上的研究表明，采后MeJA 處理能夠有效的誘導(dǎo)增強果實的抗冷性，減輕棗、草莓、桃、番茄、香蕉等采后冷害的發(fā)生，并且能夠促進營養(yǎng)成分的有效積累，在延長農(nóng)產(chǎn)品的貯藏期和提高其營養(yǎng)價值等方面起到積極的作用[11-15]。此外，MeJA可以通過誘導(dǎo)果蔬調(diào)節(jié)活性氧代謝，提高自身抗氧化能力，維護細胞壁代謝平衡，調(diào)節(jié)脯氨酸和γ-氨基丁酸等物質(zhì)合成，從而提高果實抗冷性[16-21]。

前期研究表明，‘黃冠’梨經(jīng)MeJA 處理后即使快速降溫，仍能有效抑制采后果皮褐變并保持良好的外觀、口味及較高的貨架期Vc 含量，但對硬度和可溶性固形物含量沒有顯著影響[22]。在此基礎(chǔ)上，筆者從酚類物質(zhì)代謝、活性氧積累以及抗氧化相關(guān)酶活等方面進一步探討采后MeJA處理對‘黃冠’梨果皮褐變的控制機理，為解決低溫貯藏過程中‘黃冠’果皮易褐變提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

‘黃冠’梨采摘自河北省藁城馬莊果園，采摘后選取大小一致、無機械傷、病蟲害、表面顏色均勻的果實，套網(wǎng)套，裝箱，常溫運回山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院果蔬保鮮實驗室。

1.2 儀器與設(shè)備

T6 新世紀紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；電熱恒溫水浴鍋（國華儀器有限公司）；Allegra 64R 高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；-80℃超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限公司）；微型冷庫（濟南科達爾實業(yè)有限公司）；超聲波振蕩器（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理 分別配制 1、10、100 μmol/L 的 3 組MeJA 溶液，將梨果浸入溶液（水溫20℃）中，處理3 min，水溫20℃清水浸泡3 min為對照，撈出后吸干表面溶液，進行商品化包裝后裝箱，置于-1～0℃冷庫低溫貯藏。對照組及3個處理組每組分別處理3箱梨，每箱48個梨，低溫貯藏20、40、100天，統(tǒng)計果皮褐變率及褐變指數(shù)。對照組及100μmol/L的MeJA溶液處理組每組處理3 箱梨，每箱48 個梨，每箱每次取6 個梨，低溫貯藏30天內(nèi)，分別于0、5、10、15、20、25、30天進行果皮多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanine aminolase，PAL)、過 氧 化 物 酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)的活力及過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)含量、總酚含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1-diphenyl-2-picrylhy drazyl，DPPH)自由基清除率等指標測定。

1.3.2 果皮褐變率及褐變指數(shù)測定 依據(jù)梨果表面褐變面積劃分為5個等級。0級，果皮無褐變；1級，出現(xiàn)褐變且褐變面積比例小于15%；2級，褐變面積比例15%～30%；3級，褐變面積比例30%～50%；4級，褐變面積比例大于50%。果皮褐變率及褐變指數(shù)通過公式(1)～(2)進行計算[5]。

1.3.3 總酚含量測定 樣品總酚提取、總酚標準曲線制作及樣品總酚含量測定參照Folin-酚法測定[23]，單位為mg/100 g，以鮮質(zhì)量計。

1.3.4 PPO 和PAL 酶活力測定 PPO 酶活力測定參考Jiang Yueming 等[24]的方法，以 1 g‘黃冠’梨果皮（鮮質(zhì)量）1 min內(nèi)410 nm波處下吸光度的變化為1個酶活力單位(U)。PAL酶活力的測定參考張福生等[14]的方法，以 1 g‘黃冠’梨果皮（鮮質(zhì)量）1 min 內(nèi) 290 nm 波長處吸光度的變化為1個酶活力單位(U)。

1.3.5 抗氧化酶活性測定 稱取4 g黃冠梨果皮的冷凍樣品加入8 mL 預(yù)冷的50 mmol/L 磷酸緩沖液（含5%聚乙烯吡咯烷酮和3 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉，pH 7.0），4℃條件下充分研磨后，于 12000 r/min 離心10 min，上清液用于抗氧化酶活性測定。

POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[25]，APX活性測定采用紫外吸光光度法[26]，CAT 活性測定采用比色法測定[25]。

1.3.6 DPPH 自由基清除率測定 DPPH 自由基清除率的測定參照韋獻雅等[27]的方法，結(jié)果以清除百分率表示。

1.3.7 H2O2含量測定 H2O2的測定參照劉俊等[28]的方法，單位為nmol/g，以鮮質(zhì)量計。

1.4 實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

平均數(shù)以及標準方差通過Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理分析，以平均數(shù)±標準偏差表示。數(shù)據(jù)經(jīng)過Sigmaplot 12.5 進行主成分分析，SPSS 17.0 進行顯著性分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度MeJA處理對貯藏期間‘黃冠’梨果皮褐變的影響

‘黃冠’梨在低溫貯藏過程中，隨著貯藏時間延長，果皮褐變逐漸加重，如圖1所示，對照組貯藏至40天果皮褐變率已達69%，褐變指數(shù)達31%；之后增幅不大。與對照組相比，1、10、100 μmol/L 的 MeJA 處理的‘黃冠’梨果皮褐變率及褐變指數(shù)均有所下降，其中100 μmol/L MeJA 處理對果皮褐變的抑制效果最顯著(P＜0.01)。

2.2 100 μmol/L MeJA處理對‘黃冠’梨果皮總酚含量及PPO、PAL酶活的影響

‘黃冠’梨在低溫貯藏過程中，果皮PPO酶活通常會增強，導(dǎo)致酚類物質(zhì)氧化大幅度降低，PPO和酚類物質(zhì)的代謝是導(dǎo)致‘黃冠’梨果皮褐變的直接原因[29]。PAL 是苯丙氨酸途徑第一步限速酶，它可以特異性催化苯丙氨酸合成反式肉桂酸，PAL 活性的增加可以促進黃酮類及多酚類成分含量的增加[10,14]。而MeJA 可有效透過植物細胞膜發(fā)揮信號分子作用調(diào)節(jié)眾多次生代謝產(chǎn)物包括酚類物質(zhì)等合成[30-31]。

由 2.1 節(jié)可知，100 μmol/L MeJA 處理能極顯著降低‘黃冠’梨低溫貯藏期間的果皮褐變(P＜0.01)。因此，分別測定對照組和100 μmol/L MeJA處理組的‘黃冠’梨果皮中PPO、PAL 酶活力和總酚含量，結(jié)果見圖2～3。

如圖2A 所示，對照組‘黃冠’梨低溫貯藏30 天期間，PPO 酶活力一直持續(xù)增加；與對照相比，貯藏5 天后，100 μmol/L MeJA 處理后的‘黃冠’梨果皮 PPO 酶活力逐漸降低，貯藏20 天時略有增加，但整個貯藏期間PPO酶活均一直顯著低于對照組(P＜0.01)。

如圖2B所示，對照組‘黃冠’梨在貯藏30天內(nèi)，前期（10 天內(nèi)）果皮總酚大幅度下降，隨后略有波動，貯藏20天后大幅度上升；而經(jīng)100 μmol/L MeJA處理后，‘黃冠’梨在貯藏20 天內(nèi)，果皮總酚含量下降明顯減緩，貯藏20 天后含量上升，貯藏期間含量一直顯著高于對照組(P＜0.01)。

由圖3可知，對照組‘黃冠’梨低溫貯藏5天內(nèi)PAL酶活大幅度降低，5～15 天持續(xù)增加，隨后降低但貯藏20 天后又逐漸增加；與對照相比，貯藏5 天后，100 μmol/L MeJA 處理后的‘黃冠’梨果皮 PAL 酶活性也出現(xiàn)增加、降低又增加的趨勢，但PAL 活性均一直顯著低于對照組(P＜0.01)。

圖2～3結(jié)果表明，采后100 μmol/L MeJA處理降低了‘黃冠’梨貯藏期間果皮PAL酶的活性，抑制了PPO酶活性的上升，減緩了果皮總酚的消耗。

2.3 100 μmol/L MeJA處理對貯藏期間‘黃冠’梨果皮抗氧化酶活性的影響

如圖4A 所示，貯藏期間，對照組‘黃冠’梨果皮POD 酶活力總體呈先下降后上升的趨勢。而100 μmol/L MeJA 處理顯著增加了 POD 酶活力，從而在貯藏30天期間‘黃冠’梨果皮POD酶活力一直顯著高于對照組(P＜0.01)。如圖4B所示，對照組‘黃冠’梨低溫貯藏10天內(nèi)CAT酶活力大幅度降低，10～20天內(nèi)酶活力有所上升但隨后又大幅度降低；而100 μmol/L MeJA處理顯著抑制了‘黃冠’梨低溫貯藏期間CAT酶活力的降低，從而使處理組CAT 保持在較高水平，并一直顯著高于對照組(P＜0.05)。如圖4C所示，對照組果皮APX 酶活力在貯藏25 天內(nèi)緩慢降低，后期有所上升，但100 μmol/L MeJA 處理顯著增加了果皮APX酶活力，整個貯藏期間顯著高于對照組(P＜0.01)。

2.4 100 μmol/L MeJA處理對貯藏期間‘黃冠’梨果皮H2O2含量和DPPH自由基清除率的影響

由圖5A 可知，對照組‘黃冠’梨貯藏5 天內(nèi)，H2O2含量快速上升，可見‘黃冠’梨低溫下很快發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；隨著果實對低溫逐漸適應(yīng)，H2O2含量開始下降，隨著貯藏時間延長，貯藏15 天后又開始增加。100 μmol/L MeJA 處理后，‘黃冠’梨果皮H2O2含量快速下降，貯藏10 天后雖有所上升，但整個貯藏期間顯著低于對照組。由結(jié)果可知，100 μmol/L MeJA 處理顯著降低了‘黃冠’梨貯藏期間果皮H2O2的積累，從而有效降低了H2O2對細胞膜的氧化傷害。由圖5B 可知，‘黃冠’梨果皮DPPH自由基清除率均呈下降趨勢，100 μmol/L MeJA 處理顯著抑制了 DPPH 自由基清除率的下降，有利于維持細胞抗氧化能力。

‘黃冠’梨采后入冷庫低溫貯藏，貯藏過程中極易遭受冷害，而細胞膜低溫下?lián)p傷是產(chǎn)生冷害的根本原因[5]。POD、CAT和APX作為活性氧的主要清除酶，在抑制膜脂過氧化、維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性中起重要作用[13]。由圖4～5 可知，100 μmol/L MeJA 處理采后‘黃冠’梨果實，通過顯著增加POD、APX 酶活力、有效抑制CAT 酶活力和DPPH 自由基清除率的降低，顯著降低了H2O2的積累，有利于維持低溫貯藏期間果皮中的活性氧代謝的平衡，保護細胞膜的完整性。

3 結(jié)論

（1）1、10、100 μmol/L MeJA 處理對‘黃冠’梨低溫貯藏期間果皮褐變率及褐變指數(shù)的影響程度不同，其中 100 μmol/L MeJA 處 理 效 果 顯 著 (P＜0.01)。 且100 μmol/L MeJA 處理顯著降低了 PAL、PPO 酶活力，有效地減緩了果皮總酚的消耗，從而減少了果皮褐變的發(fā)生。

（2）MeJA 處理誘導(dǎo)了采后‘黃冠’梨果皮的防御反應(yīng)，增加了低溫貯藏過程中抗氧化酶包括POD、APX、CAT酶活力，有效地抑制了DPPH自由基清除率的降低，保持了較高的抗氧化能力，從而增強了細胞清除自由基以及低溫脅迫下的修復(fù)與抵抗能力，果皮H2O2含量的降低表明MeJA處理可以降低低溫下冷害引發(fā)的自由基對細胞產(chǎn)生的傷害。

（3）MeJA 處理可以通過影響活性氧代謝和酚類物質(zhì)代謝來降低采后‘黃冠’梨低溫貯藏期間果皮褐變的發(fā)生，并能夠達到減少‘黃冠’梨雞爪病、延長貯藏期和保持新鮮品質(zhì)的目的。

4 討論

4.1 外源MeJA處理能誘導(dǎo)‘黃冠’梨果皮提高自身抗氧化脅迫能力，增強抗冷性

低溫貯藏過程中‘黃冠’梨果皮褐變的產(chǎn)生，與低溫脅迫下ROS 的增加引起的細胞膜損傷，進而導(dǎo)致PPO 酶促反應(yīng)增強、果皮酚類物質(zhì)加劇氧化等密切相關(guān)；而通過提高低溫貯藏條件下果實自身抗氧化能力的方法，往往可以減輕梨果冷害、降低果皮褐變的發(fā)生[4-6]。MeJA 作為植物體內(nèi)天然存在的生長調(diào)節(jié)劑，不僅參與調(diào)控果實發(fā)育、成熟和衰老，參與多種植物病蟲害、機械傷害等抗逆反應(yīng)，而且能夠通過誘導(dǎo)植物抗氧化防護酶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達，誘導(dǎo)果蔬調(diào)節(jié)脯氨酸和γ-氨基丁酸等物質(zhì)合成調(diào)節(jié)自身抗氧化系統(tǒng)等，來增強植物在低溫脅迫下的抗氧化防護能力，提高植物的抗冷性。MeJA 處理后的‘黃冠’梨，在低溫貯藏過程中，果皮POD、CAT、APX等抗氧化防護酶酶活力顯著高于對照組，MeJA 處理顯著增強了‘黃冠’梨果皮自身的抗氧化防護能力，從而增強了其低溫貯藏過程中的抗冷能力。

4.2 外源MeJA處理對‘黃冠’梨果皮褐變抑制的機制探討

外源MeJA 作為一種信號因子，可通過作用于植物受體細胞，激活并誘導(dǎo)脅迫應(yīng)答基因的表達等，參與植物防御信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，提高植物的生物及非生物脅迫的抗性。研究表明，外源MeJA 可誘導(dǎo)菠菜游離鈣離子濃度升高并激活抗冷轉(zhuǎn)錄因子CBF 的表達，提高其抗冷害能力[32]。外源MeJA 能夠誘導(dǎo)小麥冷特異家族WCS120、WCS19 基因的表達，提高了超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化物酶(peroxidase, PO)的活性，增強了小麥抗冷性[33]。外源MeJA 處理顯著降低了番茄果實MeJA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SlMYC2 的表達，增加了脯氨酸、番茄紅素含量，顯著提高了SOD、PO、CAT、APX 等抗氧化酶的活性，抑制了電導(dǎo)率和MDA 含量并顯著增強了番茄的抗冷性；這與筆者通過外源MeJA 處理‘黃冠’梨提高抗氧化活性，降低果皮H2O2含量進而降低果皮氧自由基傷害的結(jié)果相一致；該研究中還探討了利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)方法獲得SlMYC2 沉默型的番茄果實，而外源MeJA 對SlMYC2 沉默型的番茄果實處理后并不能提高其抗性，也進一步說明了外源MeJA 作為信號分子，是通過影響受體細胞中轉(zhuǎn)錄因子以及相關(guān)基因的表達，來提高果實抗冷性的[34]。后期筆者可通過外源MeJA 處理對梨果轉(zhuǎn)錄組進行測序分析，尋找差異表達基因，分析并研究MeJA 對抗氧化酶基因表達、冷脅迫相關(guān)蛋白基因表達、細胞膜穩(wěn)定相關(guān)蛋白基因表達的影響來進一步探討MeJA 調(diào)控梨果抗冷、果皮褐變的分子機制。