辛 娜,吳躍剛

(1.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安710077；2.西安市華山中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，陜西 西安710043)

侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis，IPA)是由曲霉引起的支氣管肺部真菌感染，免疫功能低下者是其主要高發(fā)人群。隨著社會(huì)老齡化、危重患者廣譜抗生素的長(zhǎng)期應(yīng)用， IPA的發(fā)病率也在不斷上升[1]。IPA臨床癥狀往往缺乏特異性，易被基礎(chǔ)疾病所掩蓋，病死率較高。半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)試驗(yàn)是早期診斷曲霉菌感染的一種常用血清學(xué)方法，然而目前GM 試驗(yàn)試劑盒應(yīng)用說明大多局限于血清樣本，鑒于支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 和血清標(biāo)本來源和性質(zhì)的不同，其GM 試驗(yàn)閾值的設(shè)定仍存在諸多爭(zhēng)議。本研究通過比較IPA 患者的血清及BALF的GM抗原，評(píng)估GM試驗(yàn)在不同閾值下的診斷效能，探討血清及BALF標(biāo)本GM試驗(yàn)在IPA早期診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取 2018 年 1 月至2018年8 月經(jīng)確診及臨床診斷的IPA患者25例作為病例組，符合《侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(草案)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取同期就診的非肺曲霉病的患者作為對(duì)照組(n=75)。患者一般情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

1.2 儀器與試劑GM 試劑盒：美國(guó)BIO-RAD曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司，貨號(hào)：7J0051)；Thermo MULTISKAN FC型全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取吸光度(OD值)。

1.3 標(biāo)本采集

1.3.1BALF收集 按常規(guī)支氣管鏡操作規(guī)程進(jìn)行BALF采集，注入20 ml 37℃滅菌生理鹽水對(duì)病變部位進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，回收5-10 ml BALF裝入一次性無菌硅塑瓶中及時(shí)送檢。將待測(cè)BALF用一次性無菌吸管轉(zhuǎn)移至10 ml離心管，10 000 r/min 離心 10 min后吸取上清液600-800 μl，-40℃保存待測(cè)。

1.3.2血清標(biāo)本 行支氣管鏡檢查當(dāng)日采集靜脈血3 ml，3 500 r/min 離心10 min，4℃冰箱保存待測(cè)。

1.4 GM試驗(yàn)采用一步法酶免夾心微孔板方法，檢測(cè)血清和BALF標(biāo)本中的半乳甘露聚糖。按照試劑盒說明書中的操作步驟進(jìn)行操作。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、臨界值對(duì)照以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。結(jié)果計(jì)算：GM指數(shù)(I值)=待測(cè)樣本OD值/臨界值對(duì)照OD值均值，根據(jù)GM指數(shù)進(jìn)行GM試驗(yàn)陽(yáng)性閾值的界定。

表1 兩組患者一般情況比較

2 結(jié)果

2.1 兩組血清及BALF標(biāo)本GM試驗(yàn)I值比較兩組血清及BALF標(biāo)本GM試驗(yàn)I值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.73、5.46，P均<0.05)；對(duì)照組和病例組血清與BALF GM試驗(yàn)I值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.03、7.46，P均<0.05)。見表2。

表2 兩組血清及BLAF標(biāo)本GM試驗(yàn)I值比較

注：★與病例組比較P<0.05；#血清與BALF標(biāo)本比較P<0.05

2.2 ROC 曲線分析運(yùn)用ROC曲線下面積評(píng)估兩種不同標(biāo)本類型GM試驗(yàn)對(duì)IPA的診斷效率，結(jié)果顯示BALF GM的曲線下面積(0.837)高于血清GM(0.761)。表明BALF GM試驗(yàn)的診斷價(jià)值一定程度上高于血清GM，見表3。

表3 曲線下面積

2.3 血清及BALF標(biāo)本GM 試驗(yàn)診斷 IPA 結(jié)果的評(píng)估分別以0.5、0.8、1.0、1.2、2.0作為診斷閾值，計(jì)算各診斷閾值下GM 試驗(yàn)診斷IPA 的敏感性、特異性、約登指數(shù)。以約登指數(shù)最高為原則，確定診斷閾值，本研究得到血清GM實(shí)驗(yàn)，以≥0.5為診斷閾值；BALF GM試驗(yàn)以≥0.8為診斷閾值,見表4、圖1。

表4 血清及BLAF GM試驗(yàn)不同閾值下診斷效率評(píng)估

圖1 血清GM和BLAF GM標(biāo)本診斷IPA的ROC曲線

3 討論

侵襲性肺曲霉病是重要的機(jī)會(huì)性深部真菌感染，對(duì)人體健康危害極大[2]。半乳甘露聚糖(GM)是曲霉菌細(xì)胞壁的組成成分，檢測(cè)患者血清中GM 抗原水平是曲霉菌感染早期診斷的敏感指標(biāo)[3,4]，因此臨床醫(yī)生應(yīng)高度重視曲霉菌感染的早期診斷，以助于及時(shí)采取有效的治療措施。

GM試驗(yàn)常用的標(biāo)本類型是血清和BLAF。在曲霉菌局部感染時(shí)，由于菌絲少，釋放的GM抗原量少，以及釋放入血后很快被清除等原因，導(dǎo)致血清GM試驗(yàn)容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。同時(shí)，由于真菌感染早期并未進(jìn)入血液，故血清中峰濃度出現(xiàn)較遲，不利于IPA 的早期診斷。而支氣管肺泡灌洗時(shí)無菌生理鹽水能夠直接到達(dá)肺部感染病灶，在BALF中存在大量的吞噬細(xì)胞，能將真菌吞噬后釋放較多的半乳甘露聚糖，從而提高早期診斷的敏感性[5]。目前，血清標(biāo)本的GM試驗(yàn)大多以0.5作為診斷閾值。由于BLAF和血清標(biāo)本來源和性質(zhì)的不同，BLAF進(jìn)行GM試驗(yàn)時(shí)其診斷閾值的選擇[6]，或敏感性、特異性的評(píng)價(jià)還存在較大差異[7]。ZOU 等[8]一項(xiàng)Meta 分析指出，當(dāng)cut-off值為0.50時(shí)，BALF-GM的敏感度達(dá)0.87，特異度 0.89，診斷效率較血清 GM 具有優(yōu)勢(shì)。而有文獻(xiàn)研究則考慮當(dāng) cut-off 值為 0.80 時(shí)，BALF-GM診斷效益最高[9]。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者認(rèn)為將BALF-GM試驗(yàn)的I值設(shè)定為≥2.1為陽(yáng)性結(jié)果，對(duì) IPA 更具診斷價(jià)值[10]。不同研究對(duì)于BALF-GM試驗(yàn)最佳界值和敏感度等評(píng)價(jià)存在區(qū)別，可能與具體操作及收集方法的差異、實(shí)驗(yàn)人群選擇的不同相關(guān)。有研究顯示[11]采用小劑量灌洗對(duì)重癥呼吸衰竭患者安全性較高，避免在灌洗過程中將霉菌及定值菌等播散到遠(yuǎn)處，引起感染或炎癥加重的風(fēng)險(xiǎn)。因此本研究所有BALF的采集均采用小劑量灌洗，排除因灌洗量不同造成試驗(yàn)結(jié)果的差異。

本研究中，病例組和對(duì)照組血清及BALF標(biāo)本GM試驗(yàn)I值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且同組內(nèi)血清標(biāo)本與BALF標(biāo)本GM試驗(yàn)的I值也存在顯著性差異,這也提示，血清標(biāo)本和BALF標(biāo)本GM檢測(cè)使用同一診斷閾值可能存在一定的不足。比較不同閾值下血清及BLAF GM試驗(yàn)診斷IPA的效能，結(jié)果顯示當(dāng)血清GM界值≥0.5時(shí)，敏感性40%，特異性96%，約登指數(shù)最大為0.36。而BALF GM界值≥0.5時(shí)，敏感性92%，特異性54.7%；界值≥0.8時(shí)，敏感性92%，特異性提高到65.3%，約登指數(shù)最大為0.57；界值≥1.0時(shí)，敏感性顯著下降，只有76%。約登指數(shù)是綜合評(píng)價(jià)篩查試驗(yàn)準(zhǔn)確性的方法，指數(shù)越大說明篩查試驗(yàn)的準(zhǔn)確性越高、效果越好。因此，本研究認(rèn)為血清 GM界值設(shè)定為0.5較合適，而BALF GM界值設(shè)定為0.8較合適，具有較高的敏感性和相對(duì)較好的特異性。

目前文獻(xiàn)報(bào)道血清GM試驗(yàn)診斷IPA的敏感度、特異度分別為60%-100%、80%-100%[12],而在肺泡灌洗液中，如果以吸光度>0.5作為IPA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其敏感度、特異度可達(dá) 80%-93%、89%-98%[13,14]。本研究中血清GM試驗(yàn)和文獻(xiàn)比較敏感性偏低，只有40%，分析原因可能是因?yàn)楸狙芯坎±M樣本量較少，多為年老體弱的ICU患者，合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，造成試驗(yàn)結(jié)果存在一定程度上的偏倚。然而也有文獻(xiàn)表明GM試驗(yàn)在不同研究對(duì)象中的結(jié)果存在一定差異[15]，推測(cè) GM 試驗(yàn)可能需要根據(jù)不同的基礎(chǔ)疾病或免疫力等而設(shè)定不同的最佳界限值，這方面可能需要更多的研究去證實(shí)。本研究中BLAF GM試驗(yàn)和文獻(xiàn)比較特異性偏低，只有65.3%，分析原因可能是對(duì)照組中部分患者臨床診斷為吸入性肺炎，普遍存在誤吸病史，可能食物中的GM抗原進(jìn)入呼吸道導(dǎo)致假陽(yáng)性，也有可能是BALF樣本與外界空氣環(huán)境為開放性，使一些青霉菌、曲霉菌污染樣本，導(dǎo)致GM實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)假陽(yáng)性。

綜上所述，血清標(biāo)本和BALF標(biāo)本GM試驗(yàn)在IPA的早期診斷中都有重要的價(jià)值，BALF 標(biāo)本 GM 試驗(yàn)的診斷效能一定程度上高于血清標(biāo)本。由于血清及BALF GM試驗(yàn)的敏感性和特異性有所差別，臨床應(yīng)用中建議多次送檢同時(shí)結(jié)合不同標(biāo)本類型進(jìn)行綜合判斷，從而更好的發(fā)揮GM試驗(yàn)在IPA早期診斷中的價(jià)值。