徐憲偉，徐小艷，王 娜，姜 黃，滑洋洋，楊金花

乳腺非特殊型浸潤性癌，舊版WHO中稱為浸潤性導管癌，是乳腺癌最常見的類型，在公開發(fā)表的文獻統(tǒng)計病例中占40%～70%，且預后較差。CD34是血管的特異性標志物，存在于微血管的內(nèi)皮細胞，能通過抗體與血管內(nèi)皮細胞結(jié)合，促進血管內(nèi)皮的分裂和毛細血管的出芽生長，促進新血管的生成，可直接反映微血管的生成情況。Ki67是一個標記細胞增殖狀況的常用指標，尤其經(jīng)常用于反映惡性腫瘤細胞的增殖狀況。既往在乳腺非特殊型浸潤性癌的研究中，CD34和Ki67表達的相關(guān)性少見報道，因此筆者采用免疫組織化學方法檢測乳腺非特殊型浸潤性癌組織中CD34和Ki67的表達，并分析兩者之間的相關(guān)性及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，以期為乳腺非特殊型浸潤性癌發(fā)病機制提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料收集鄭州人民醫(yī)院2018年1月—2018年12月的病理活檢標本原發(fā)非特殊型浸潤性癌97例，均為女性患者，術(shù)前均未接受放療、化療、生物治療等輔助治療，收集臨床資料，按2012版WHO乳腺癌組織病理分級分類法進行TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期56例，Ⅲ期20例；腫塊最大徑≤2 cm者35例，＞2 cm且≤5 cm者 57例，＞5 cm者5例：伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者45例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例，組織學分級Ⅰ級8例，Ⅱ級68例，Ⅲ級21例，相應的癌旁正常乳腺組織為對照組。所有病例均經(jīng)過兩位中級及以上病理醫(yī)師復診證實。

1.2 方法新鮮切除的乳腺組織標本，均采用北京益利精細化學品有限公司的10%中性緩沖甲醛固定液進行固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片進行HE及免疫組化染色。采用Leica公司的BOND-MAX免疫組化機進行免疫組織化學染色，其中一抗試劑為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司鼠抗人CD34、鼠抗人Ki67單克隆即用型試劑，二抗試劑均為英國Leica Biosystems Newcastle Ltd公司產(chǎn)品。主要步驟如下：（1）石蠟組織切片、烤片、脫蠟并水化；（2）EDTA 修復 20 min；（3）過氧化酶封閉劑 5min；（4）一抗孵育 15 min；（5）一抗后試劑 8 min；（6）多聚物 8 min；（7）DAB 顯色 10 min；（8）蘇木素復染 5 min；（9）脫水、透明和封片。

1.3 結(jié)果判讀Ki67染色結(jié)果采用相對定量法：乳腺非特殊型浸潤性癌以Ki67陽性的癌細胞數(shù)占癌細胞總數(shù)的百分比作為標記指數(shù)，方法：隨機觀察5個高倍視野（×200倍），以每個視野下“Ki67陽性腫瘤細胞數(shù)/腫瘤細胞總數(shù)”×100%的平均數(shù)作為Ki67標記指數(shù)；乳腺良性導管上皮增生以Ki67陽性增生導管上皮細胞數(shù)占增生導管上皮細胞總數(shù)的百分比作為Ki67的標記指數(shù)。MVD（microvessel density）計數(shù)采用Chalkley記數(shù)法，由兩位事先不知道臨床資料的病理醫(yī)師在低倍光鏡視野下掃視整個切片尋找3個CD34染色陽性的脈管高密度集中的區(qū)域作為“熱點”（hot spots），然后在 200倍光鏡視野下計數(shù)微脈管的數(shù)目，但應忽略管腔直徑＞8個紅細胞或管壁有平滑肌存在的脈管。取3個視野的微脈管數(shù)的平均值作為該標本的MVD。兩位醫(yī)師計數(shù)差異10%以上者重新計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17．0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間計量資料均數(shù)比較采用t檢驗和方差分析，如果方差齊，采用LSD檢驗，如果方差不齊，采用Dunnett’s T3檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果CD34定位于內(nèi)皮細胞膜和（或）胞質(zhì)，呈顆粒狀，在癌組織中均有不同程度的表達，并且分布不均，在癌組織邊緣呈高表達，在較大血管中也有表達。乳腺非特殊型浸潤性癌MVD（48．20±21．02）高于良性對照組（8．75±4．82），有顯著性差異（P＜0．05）；Ki67 定位于細胞核，染色呈棕黃色，其在普通型增生的乳腺導管上皮上不表達或有少量的表達，其在乳腺非特殊型浸潤性癌細胞有較高的表達，其中乳腺非特殊型浸潤性癌Ki67標記指數(shù)（37．88±27．10）高于良性對照組 Ki67 標記指數(shù)（2．80±1．85），有顯著性差異（P＜0．05），見圖 1。

圖1見封三。

下圖1：徐憲偉，徐小艷，王 娜，等.乳腺非特殊型浸潤性癌組織中CD34和Ki67的表達及相關(guān)性＊（正文144～147頁）

圖1 MVD和Ki67在乳腺非特殊類型浸潤性癌中的表達（免疫組織化學，200×）

2.2 MVD和Ki67分別與乳腺非特殊型浸潤性癌患者臨床病理特征的關(guān)系97例乳腺非特殊型浸潤性癌中，MVD與腫瘤的直徑、組織學分級及pTNM 分期有關(guān)（P＜0．05）。 MVD 在腫瘤最大直徑≤2 cm、 ＞2≤5 cm、 ＞5 cm 組 中 分 別 為 30．71±6．55，54．91±17．26，94．00±11．40， 整體比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=59．866，P=0．000），其中兩兩比較均有統(tǒng)計學意義（P均=0．000）；MVD 在組織學分級Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級表達依次升高，分別為32．22±8．33，47．28±20．18，58．50±23．06， 整體比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=5．547，P=0．005），其中Ⅰ級與Ⅱ級比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0．001），Ⅰ級與Ⅲ級比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0．000），Ⅱ級與Ⅲ級比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0．164）；MVD 在 pTNM 分期Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期中表達依次升高， 分別為 30．24±6．80、48．48±17．53、66．25±24．38， 整體比較差異均具有統(tǒng)計學意義（F=21．464，P=0．000），其中兩兩比較均有統(tǒng)計學意義（P 均=0．000）；MVD 與患者年齡、腫瘤部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0．05）。

Ki67與腫瘤的直徑、組織學分級及pTNM分期有關(guān)（P＜0．05）。 Ki67 陽性指數(shù)在腫瘤最大直徑≤2 cm、＞2≤5 cm、＞5 cm 組中分別為 26．60±22．95，44．53±27．70，41．00±25．59， 整體比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=5．196，P=0．007），其中≤2 cm 與＞2≤5 cm比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0．004），≤2 cm 與＞5 cm比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0．591），＞2≤5 cm 與＞5 cm比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0．986）；Ki67陽性指數(shù)在組織學分級Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級表達依次升高，分別為 11．67±7．91，36．97±26．65，52．75±24．89，整體比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=8．374，P=0．000），其中Ⅰ級與Ⅱ級比較 P=0．006， Ⅰ級與Ⅲ級比較 P=0．000，Ⅱ級與Ⅲ級比較P=0．016，差異均具有統(tǒng)計學意義；Ki67陽性指數(shù)在 pTNM分期中分別為 21．00±19．95，42．11±28．90，43．75±21．70，整體比較差異有統(tǒng)計學意義（F=5．739，P=0．004），其中 Ki67 陽性指數(shù)在pTNMⅠ期和Ⅱ期比較差異有統(tǒng)計學意義 （P=0．002），Ⅰ期和Ⅲ期比較差異有統(tǒng)計學意義 （P=0．006），Ⅱ期和Ⅲ期比較差異無統(tǒng)計學意義 （P=0．808）。Ki67與患者年齡、腫瘤部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0．05）。 見表 1。

表1 乳腺非特殊類型浸潤性癌中MVD和Ki67與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系（x±s）

2.3 MVD和Ki67蛋白相關(guān)性分析對CD34和Ki67在乳腺非特殊型浸潤性癌中的表達分別進行Spearman相關(guān)分析，二者呈正相關(guān)，即MVD值越大，Ki67 指數(shù)越高（r=0．632，P=0．000）。

3 討論

CD34于1986年被發(fā)現(xiàn)，為單鏈高度糖基化型跨膜蛋白，存在于微血管的內(nèi)皮細胞，它能通過抗體與相應的血管內(nèi)皮細胞結(jié)合，增加內(nèi)皮細胞的化學趨向性，促進血管內(nèi)皮的分裂和毛細血管出芽生長，誘導蛋白溶解酶生成，有利于內(nèi)皮細胞穿過基質(zhì)，促進新生血管形成。因此，CD34被認為是血管特異的標志物［1］，可直接反映微血管的生成情況。通過該實驗發(fā)現(xiàn)乳腺非特殊型浸潤性癌組織中微血管密度明顯高于乳腺良性病變組織，提示癌組織有明顯的血管新生，在癌巢周邊及浸潤前緣血管新生更加明顯。微血管密度在腫瘤大小、組織學分級及pTNM分期分組中的差異有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果表明原發(fā)腫瘤越大、組織學分級越高、pTNM分期越晚的乳腺癌微血管形成越多。甄樂鋒［2］、徐小艷［3］等研究認為CD34與腫瘤大小，組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期有關(guān)，與該結(jié)果基本相似，但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性存在不一致性，該實驗CD34的表達中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，但差異無統(tǒng)計學意義，可能跟樣本含量有關(guān)。

Ki67是一種在增殖細胞核基質(zhì)內(nèi)表達的核蛋白，定位于第10號染色體上，于1983年由Gerdes等發(fā)現(xiàn)［4］。它的功能和細胞有絲分裂有關(guān)，與腫瘤細胞的周期性變化密切相關(guān)。由于其半衰期短，Ki67抗原在細胞分裂晚期很快消失，脫離細胞周期后迅速降解，被認為能夠比較理想的反映細胞增殖活性，是目前評估腫瘤細胞增殖活性、判斷腫瘤侵襲力和腫瘤預后的最可靠的指標［5-8］。該實驗中乳腺非特殊型浸潤性癌Ki67標記指數(shù)明顯高于良性對照組Ki67標記指數(shù)，同時Ki67陽性表達與腫瘤大小、組織學分級及pTNM分期呈正相關(guān)。既往文獻報道Ki67在乳腺癌中的表達與臨床病理特征關(guān)系的研究中，閻曉路［9］、夏紅強［10］等認為 Ki67 的表達與pTNM分期、腫瘤大小、組織學分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而李寶江［11］、連婧［12］則認為與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小無關(guān)。Ahmed等［13］研究結(jié)果表明Ki67可以判斷乳腺癌獨立預后因子，但是與腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況無關(guān)。

CD34 和 Ki67 的相關(guān)性在肝癌［14］、胃癌［15］等腫瘤中均有研究報道，且研究顯示二者呈正相關(guān)。以往有關(guān)乳腺癌CD34和Ki67的研究中，二者單獨研究較常見，而相關(guān)性的研究尚未見同類報道。該文相關(guān)分析結(jié)果研究表明乳腺非特殊型浸潤性癌中CD34和Ki67的表達呈明顯正相關(guān)，并與乳腺非特殊型浸潤性癌的病理分期關(guān)系密切，結(jié)果提示兩者在乳腺非特殊型浸潤性癌的進展中發(fā)揮著重要作用，筆者認為在乳腺非特殊型浸潤性癌的發(fā)展中CD34的高表達提示更多新生血管的形成，為癌細胞的復制增殖提供了更多的營養(yǎng)物質(zhì)，促進了Ki67的高表達，更多的癌細胞生成加快了癌組織的生長和轉(zhuǎn)移。選擇對CD34抑制劑的開發(fā)使用有望成為抑制乳腺非特殊型浸潤性癌生長和轉(zhuǎn)移的有效途徑，該文僅用免疫組化得出上述推測證據(jù)尚不充分，其具體機制有待后續(xù)深入研究。

綜上所述，CD34和Ki67在乳腺非特殊型浸潤性癌中均與腫瘤大小、組織學分級、pTNM有關(guān)，二者表達呈正相關(guān)，對二者表達規(guī)律及相關(guān)性的研究將進一步拓展了人們對乳腺非特殊型浸潤性癌發(fā)病機制的認識。