周瑩珊，陳 琳，周 柯，王雨萌，邵春艷，楊永春，黃保續(xù)，王曉杜*，宋厚輝*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點實驗室/動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程實驗室，浙江 杭州 311300；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032)

我國是畜禽養(yǎng)殖大國，禽類養(yǎng)殖量位居世界前列，養(yǎng)殖量約為120億只[1]。H9、H5、H7亞型禽流感及新城疫、禽偏肺病毒病、傳染性支氣管炎和傳染性喉氣管炎是嚴重危害我國禽業(yè)發(fā)展的7種最重要的禽病毒性呼吸道疾病[2]。這7種病原多呈現(xiàn)混合感染的態(tài)勢，給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失，并且混合感染也很難通過臨床癥狀和病理變化對致病原因進行確診。目前尚沒有一種方法可以一次性對引起禽呼吸道疾病的這7種病毒進行鑒別檢測。因此建立一種能精準快速區(qū)分不同病毒的檢測方法，對于禽呼吸道疾病的預(yù)防和早期干預(yù)至關(guān)重要。

多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)最早是由SCHOUTEN等[3]于2002年首次報道，是一種結(jié)合核酸雜交和PCR擴增的高通量多重核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)在同一反應(yīng)管中可對多達40個不同的靶基因進行檢測分析。MLPA的基本程序包括左右探針分別與靶序列DNA雜交，連接酶連接左右探針，生成一條兩端分別含有通用引物的長度唯一的全長探針，PCR擴增全長探針并對擴增產(chǎn)物毛細管電泳后得到數(shù)據(jù)進行分析[4]。

本研究旨在建立一種同時檢測引起禽呼吸道感染的7種病毒的MLPA檢測技術(shù)，為禽呼吸道病毒的鑒別診斷和應(yīng)急檢測提供技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品和感染陽性組織122份禽鼻腔拭子樣品來自浙江農(nóng)林大學(xué)動物健康檢測中心和中國科學(xué)院流感研究與預(yù)警中心監(jiān)測網(wǎng)點。禽流感H9、H5、H7亞型病毒陽性組織及新城疫病毒陽性組織、禽偏肺病毒陽性組織、傳染性支氣管炎病毒陽性組織和傳染性喉氣管炎病毒陽性組織均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑MEGAscript T7試劑盒購自Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO(上海東洋紡)；One Step Ahead RT-PCR Kit購自QIAGEN公司；DNA/RNA共提取試劑盒購自Tiangen生物技術(shù)有限公司；pGEM-5zf載體購自Promega公司；SALSA MLPA EK1 Reagent Kit(MRC Holland)購自廈門致善生物科技有限公司。

1.3 引物、探針的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank收錄的病毒全基因組序列，利用Geneious 8.1.4軟件進行序列比對尋找高度保守區(qū)域的基因。用Primer3進行引物設(shè)計(表1)，用于特異性反轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴增，這些引物擴增的片段包含MLPA探針結(jié)合的區(qū)域。探針設(shè)計參照Designing synthetic MLPA probes，Version 15(www.mlpa.com)。探針分別結(jié)合AIV H9、H5、H7亞型的HA基因及NDV的M基因、aMPV的N基因、IBV的M基因中、ILTV的糖蛋白C(Glycoprotein C)基因高度保守區(qū)域(表2)。左側(cè)探針(left probe，LP)由兩段核苷酸組成，一段是用于PCR擴增的通用序列，另一段是病毒特異性序列(left hybridising sequence，LHS)；右側(cè)探針(right probe，RP)由兩段核苷酸組成，一段是病毒特異性序列(right hybridising sequence，RHS)，另一段是用于PCR擴增的通用序列，右側(cè)探針的5′端進行磷酸化處理。通過設(shè)計不同長度的探針區(qū)分不同病原。引物和探針均由金唯智(蘇州)生物有限公司合成。

表1 反轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴增引物名稱和序列

表2 MLPA探針針對的靶基因及左側(cè)探針和右側(cè)探針序列

1.4 陽性質(zhì)粒和體外轉(zhuǎn)錄RNA的制備將AIV H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV、ILTV的靶基因經(jīng)PCR擴增純化回收后的目的片段克隆至pGEM-5zf載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞得到重組菌，PCR鑒定陽性的菌液經(jīng)測序正確后獲得陽性重組質(zhì)粒。將包含AIV H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV核酸的重組質(zhì)粒線性化之后，用Ambion公司的MEGAscript T7試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄。將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用LiCl沉淀，70%乙醇洗滌后溶于無RNase的ddH2O中，核酸電泳檢測RNA合成的完整性和正確性，并測定RNA濃度。

1.5 樣品核酸的提取和cDNA的制備用DNA/RNA共提取試劑盒提取樣品中的DNA和RNA，得到100 μL樣品。按照One Step Ahead RT-PCR Kit說明書進行一步法反轉(zhuǎn)錄RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：50℃ 10 min；95℃ 5 min；95℃ 15 s，57℃ 20 s，72℃ 20 s，30個循環(huán)；72℃ 2 min。

1.6 MLPA反應(yīng)MLPA反應(yīng)程序嚴格按照SALSA MLPA EK1 Reagent試劑盒說明書進行。每管加入1.5提取中DNA 1 μL和4 μL TE溶液，98℃變性5 min，降至室溫25℃。再加入1.5 μL MLPA緩沖液和1.5 μL探針混合液(每條探針終濃度為1.33 nmol/L)，95℃溫育1 min，60℃雜交1 h，54℃溫育。加入32 μL連接酶混合物，54℃溫育15 min，98℃加熱5 min滅活連接酶，20℃溫育。室溫下加入10 μL PCR混合物。進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，35個循環(huán)；72℃孵育20 min，降至15℃。PCR擴增產(chǎn)物用全自動核酸分析儀(Qsep100 DNA Analyzer，BIOptic)進行分析。

1.7 特異性測試

1.7.1單一探針特異性測試 分別以AIV H9，H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV、ILTV病毒核酸和無病毒對照為模板進行MLPA擴增，對每種病毒探針和對應(yīng)的反應(yīng)體系進行特異性試驗，驗證不同病毒之間是否會發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.7.2混合探針特異性測試 用針對7種病毒混合的探針分別對AIV H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV、ILTV的病毒核酸和無病毒對照為模板進行MLPA擴增。測試混合探針能否從各自的病毒核酸中擴增出單一的特異性擴增峰，驗證探針混合之后是否會引起非特異性交叉反應(yīng)。

1.8 靈敏度測試將上述已知濃度的AIV H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV的RNA和ILTV的DNA溶液各進行10倍梯度稀釋進行MLPA反應(yīng)，分別確定其檢測極限，按以下公式計算拷貝數(shù)：(Copies/μL)=(6.02×1023Copies/mol)×質(zhì)量濃度(g·L-1)/MW(g·mol-1)。

1.9 臨床樣品的檢測臨床樣品按照前述方法提取樣品總核酸，用本研究建立的MLPA檢測方法進行檢測。AVI H9、H5和H7亞型及NDV、aMPV、IBV、ILTV分別用相應(yīng)的國家或行業(yè)標準進行PCR檢測，驗證MLPA方法與現(xiàn)有核酸檢測方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 探針特異性測試結(jié)果分別以AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV、ILTV的病毒核酸和無病毒對照為模板，利用相應(yīng)的特異性探針進行MLPA擴增。結(jié)果顯示，單一探針只能從對應(yīng)病毒核酸中擴增得到特異性條帶，條帶大小分別為92,97，102，120，127，134，142 bp，均與預(yù)期一致(圖1)，表明本研究所設(shè)計的7種病毒MLPA探針及對應(yīng)的反應(yīng)體系特異性良好，都只能檢測出對應(yīng)的目的病毒核酸，與其他病毒核酸無交叉反應(yīng)。

圖1 單一探針特異性MLPA擴增結(jié)果 A.H9探針；B.H5探針；C.H7探針；D.NDV探針；E.aMPV探針；F.IBV探針；G.ILTV探針。1～7.H9、H5、H7、NDV、aMPV、IBV和ILTV模板；M.DNA標準相對分子質(zhì)量；NC.陰性對照。

分別以AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV、ILTV的病毒核酸和無病毒對照為模板，用7種病毒的混合探針進行MLPA擴增。結(jié)果顯示，AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV和ILTV分別在約92,97,102,120,127,134,142 bp處有特異性擴增峰，與預(yù)期相符(圖2),表明7種探針混合后其特異性沒有受到影響，檢測某一種病毒核酸時只能擴增出單一的特異性擴增峰，無病毒對照無擴增峰。

圖2 混合探針特異性擴增結(jié)果 A.峰圖;B.膠圖

2.2 7種病毒核酸混合物的MLPA擴增結(jié)果以7種病毒混合核酸為模板進行MLPA擴增，結(jié)果顯示，1個MLPA反應(yīng)同時擴增出了大小約92,97,102,120,127,134,142 bp的7條特異性條帶，分別對應(yīng)于AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV、ILTV的基因片段，與預(yù)期擴增大小相符合(圖3),表明建立的MLPA可以同時檢測到模板中的這7種病毒核酸。

圖3 7種病毒核酸混合物的MLPA擴增結(jié)果

2.3 靈敏度測試結(jié)果以不同稀釋度的核酸作為模板進行MLPA擴增。結(jié)果顯示，該方法最低檢測到的AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV、ILTV 7種病毒核酸的拷貝數(shù)分別約為1.4×102,1.4×102,1.4×102,1.33×101,1.42×101,1.25×102,5.3×100拷貝/反應(yīng),表明該方法對7種病毒核酸檢測靈敏度均較高。

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果對122份臨床樣品進行反轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴增后進行7重MLPA擴增，結(jié)果顯示，AIV H7核酸陽性檢測數(shù)為2份，NDV陽性樣本12份，aMPV陽性樣本36份，IBV陽性樣本8份，ILTV陽性樣本17份，未檢出H5或H9陽性樣本(表3)。MLPA檢測結(jié)果與國家標準檢測結(jié)果一致,表明MLPA方法的特異性、敏感性較好(表4)。AIV H5和H9由于缺乏陽性樣品，無法計算敏感性。

表3 122份臨床病料中MLPA檢測方法與 PCR檢測方法的結(jié)果分析

表4 與國家標準相比MLPA檢測方法敏感性與特異性結(jié)果分析

3 討 論

動物疾病多重檢測技術(shù)的研究近年來已經(jīng)成為動物病原學(xué)診斷、疫情監(jiān)測、疫病控制領(lǐng)域關(guān)注的焦點。多重連接探針擴增技術(shù)已經(jīng)在人類基因或基因片段的缺失或重復(fù)，染色體重排，單核苷酸多態(tài)性和點突變，基因乙酰化定量中得到廣泛應(yīng)用[5-6]，但是在病毒檢測尤其是動物病毒的高通量檢測中應(yīng)用較少[7]。

為了提高MLPA檢測的靈敏度，本研究增加了反轉(zhuǎn)錄和預(yù)擴增過程，使得原本需要雜交16 h縮短為雜交1 h即可，極大地縮短了反應(yīng)時間[8]。MLPA技術(shù)的關(guān)鍵是引物的設(shè)計[9]。本研究針對病毒高度保守的基因設(shè)計了7對探針，每種探針只能擴增對應(yīng)的病毒片段，特異性好，不同探針之間沒有交叉反應(yīng)。為了易于區(qū)分不同病毒，每個病毒的核酸片段大小區(qū)分至少在5 bp以上。由于MLPA擴增的目的片段長度差距比較小，一般凝膠電泳無法區(qū)分，檢測結(jié)果需要進行毛細管電泳才能分離。通過設(shè)立陽性質(zhì)粒對照，可以通過讀取擴增片段的堿基數(shù)直接進行結(jié)果的判定[10]。

綜上所述，本研究建立了一種鑒別檢測AIV H9、AIV H5、AIV H7、NDV、aMPV、IBV和ILTV共7種病毒的高通量檢測技術(shù)。該方法特異性強，敏感性高，具有一定的臨床應(yīng)用價值，可以為禽呼吸道病毒性疾病的鑒別診斷和流行病學(xué)監(jiān)測提供技術(shù)支持。