史甜甜, 李強(qiáng)明, 潘利華, 羅建平, 查學(xué)強(qiáng)

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)俗稱米斛,是蘭科石斛屬多年生的草本植物,具有較高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值。前期的研究發(fā)現(xiàn),多糖是霍山石斛的主要活性成分之一,具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、降血糖[3]等作用?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)是多糖藥效發(fā)揮的基礎(chǔ),研究表明應(yīng)用化學(xué)修飾技術(shù),對(duì)多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,能夠明顯提高多糖的生物活性[4]。當(dāng)前,常見(jiàn)的多糖結(jié)構(gòu)修飾方法有硫酸化、磷酸化、乙?；⑼榛⒘u丙基化等,而硫酸化修飾是近年來(lái)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)修飾的代表性方法之一,能大幅提高多糖的生物活性[5-8]。

在非酶促條件下,蛋白質(zhì)與羰基化合物經(jīng)過(guò)縮合、環(huán)化、異構(gòu)化重排形成穩(wěn)定的酮胺化合物,即Amadori 產(chǎn)物。該產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)氧化、降解、脫水以及重排產(chǎn)生醛類、二羰基化合物等中間產(chǎn)物。這些中間產(chǎn)物可以繼續(xù)與氨基縮合,最終形成一系列復(fù)雜的、穩(wěn)定的糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)[9],這一過(guò)程被稱為蛋白質(zhì)的非酶糖基化反應(yīng)。糖基化終產(chǎn)物AGEs可以與機(jī)體中的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),從而引發(fā)一系列疾病,如糖尿病、心血管疾病等。因此,通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)進(jìn)行干預(yù),將有助于預(yù)防和治療與此相關(guān)的疾病。

本文將在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,采用定位硫酸化的方法對(duì)霍山石斛多糖(Dendrobiumhuoshanensepolysaccharide, DHP)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,以期增強(qiáng)霍山石斛多糖對(duì)蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍山石斛采自安徽省霍山縣大別山區(qū)。氨基胍、牛血清白蛋白、疊氮鈉購(gòu)于Sigma公司,氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)購(gòu)于Biosharp公司。其他試劑均為分析純,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

MCO-17AIC型恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社);V-1100型可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);1260 Infinity Series型高效液相色譜儀(Agilent公司);PE Paragon 1000 FT型紅外波譜分析儀(Perkin-Elmer公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

霍山石斛類原球莖的誘導(dǎo)與繁育。將霍山石斛苗莖段接種于MS基本培養(yǎng)基中,(25±2) ℃下誘導(dǎo)原球莖。40 d后將生長(zhǎng)良好的原球莖從莖段外植體上分離下來(lái)于無(wú)激素固體MS基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng),30 d為一個(gè)培養(yǎng)周期,連續(xù)繼代培養(yǎng)6～10代,取生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)物為實(shí)驗(yàn)材料[10]。

霍山石斛多糖DHP的提取分離純化。按本課題組的方法[11]提取、分離和純化DHP。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的霍山石斛原球莖,粉碎后加入一定體積蒸餾水,水提、醇沉并用Sevage法[12]除去蛋白質(zhì),得到總多糖。再經(jīng)DEAE-Celluose柱分離,收集得到的多糖用2 000 Da透析袋透析后再用8 000～14 000 Da透析袋透析得到袋內(nèi)大分子多糖即為DHP。

定位硫酸化DHP的制備。準(zhǔn)確稱量100 mg DHP、500 mg 4,4′-二甲氧基三苯甲基氯甲烷(DMT-Cl)、10 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于三口燒瓶中,緩慢加入10 mL 甲酰胺(FA),75 ℃條件下攪拌7 h后將溫度降至0 ℃,逐滴加入0.5 mL三氟乙酸酐攪拌3 h后于室溫條件下攪拌1 h。將反應(yīng)溶液加入到無(wú)水乙醇中,并反復(fù)用氯仿和無(wú)水乙醇洗滌得到中間產(chǎn)物。加入80%乙酸溶液室溫?cái)嚢? h,隨后加入無(wú)水乙醇,靜置過(guò)夜,離心(10 000 r/min,10 min)得到沉淀。將醇沉得到的產(chǎn)物按照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行硫酸酯化反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后調(diào)節(jié)pH值至7.0,加入無(wú)水乙醇,靜置過(guò)夜,離心(10 000 r/min,10 min)得到沉淀。將所得產(chǎn)物溶于蒸餾水,于60 ℃攪拌4 h,透析,冷凍干燥得到6-O-硫酸化霍山石斛多糖衍生物(6-O sulfatedDendrobiumhuoshanensepolysaccharide derivatives,6-O-SDHPD)。

稱量100 mg DHP、500 mg 4,4′-二甲氧基三苯甲基氯甲烷(DMT-Cl)、10 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于三口燒瓶中,緩慢加入10 mL 甲酰胺(FA),75 ℃條件下攪拌7 h后加入酯化試劑。反應(yīng)結(jié)束后調(diào)節(jié)pH值為7.0,并加入無(wú)水乙醇醇沉。將醇沉物溶于80%的乙酸溶液,室溫?cái)嚢? h,再加入無(wú)水乙醇醇沉,離心(10 000 r/min,10 min)得到沉淀,溶于蒸餾水,透析后冷凍干燥得到2,2′,4-O-硫酸化霍山石斛多糖衍生物(2,2′,4-O sulfatedDendrobiumhuoshanensepolysaccharide derivatives,2,2′,4-O-SDHPD)。

多糖的分子量測(cè)定。采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定多糖分子量[14]。本實(shí)驗(yàn)所用色譜條件為:色譜柱為TSK G5000PWxl(7.8×300 mm)和TSK G54000PWxl(7.8×300 mm)串聯(lián),檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器,流動(dòng)相為超純水,柱溫為30 ℃,流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL。

硫酸根取代度測(cè)定。硫酸化多糖中硫酸根取代度測(cè)定采用氯化鋇明膠法[15],其計(jì)算公式如下:

(1)

其中,w為硫元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定。硫酸化多糖的碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定用苯酚硫酸法[16]。

紅外光譜分析。稱取2 mg 干燥的6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD樣品,與KBr充分混合研磨、壓片后進(jìn)行傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared,FTIR)掃描(4 000～400 cm-1)。

抗蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系建立。在超凈工作臺(tái)中,向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入5 mL牛血清白蛋白溶液(20 mg/mL)和葡萄糖溶液(500 mmol/L),即為完整的蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系。用200 mmol/L pH值為 7.4的巴比妥鈉緩沖液溶解一定質(zhì)量多糖定位硫酸化衍生物,過(guò)濾除菌后,加入到完整的蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系,使其終質(zhì)量濃度分別為1、0.1 mg/mL;同樣,以巴比妥鈉緩沖液溶解一定質(zhì)量氨基胍作為陽(yáng)性對(duì)照,除菌后加入到完整的蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系中,使其終質(zhì)量濃度分別為1、0.1 mg/mL。所有反應(yīng)物在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。連續(xù)培養(yǎng)28 d,每隔7 d測(cè)定1次。

Amadori產(chǎn)物測(cè)定。準(zhǔn)確吸取0.5 mL培養(yǎng)液于2.0 mL含 0.3 mmol/L NBT的碳酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L, pH值為10.35)中,混合均勻,在室溫條件下孵化15 min。在530 nm處測(cè)定吸光值,并對(duì)非酶糖基化抑制率IR進(jìn)行計(jì)算,以碳酸鈉緩沖液為空白對(duì)照,具體計(jì)算公式如下:

(2)

其中,A空白為空白組的吸光值;A藥物為治療組的吸光值。

二羰基化合物測(cè)定。準(zhǔn)確吸取0.4 mL培養(yǎng)液于0.2 mL 500 mmol/L吉拉德-T儲(chǔ)備液和3.4 mL 500 mmol/L的甲酸鈉溶液(pH值為2.9)中,混合均勻,于室溫下孵育1 h。在294 nm處測(cè)定吸光值,并按(2)式對(duì)非酶糖基化抑制率IR進(jìn)行計(jì)算。以甲酸鈉溶液為空白對(duì)照。

糖基化終產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取0.1 mL培養(yǎng)液,稀釋至3 mL,在激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm處測(cè)定樣品的熒光值F,并對(duì)非酶糖基化的抑制率IR進(jìn)行計(jì)算,具體計(jì)算公式如下：

(3)

其中,F空白為空白組的熒光值;F藥物為治療組的熒光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)取(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差),采用SPASS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 常規(guī)指標(biāo)分析

6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的分子量、取代度和碳水化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)表1所列, 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的分子量相近,分別為7.59×106、6.49×106Da;碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為45.43%、51.17%;6-O-SDHPD的硫酸基取代度為0.813,高于2,2′,4-O-SDHPD的硫酸基取代度,表明6位伯羥基較活潑容易被硫酸根取代。

表1 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

2.2 多糖的FTIR分析

傅里葉紅外光譜是檢測(cè)官能團(tuán)的重要手段,6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的FTIR譜圖如圖1所示。

圖1 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的FTIR譜圖

從圖1可以看出,這2種硫酸化衍生物均具有典型的多糖特征吸收峰。3 398 cm-1附近有一個(gè)很強(qiáng)的—OH伸縮振動(dòng),2 932 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于C—H的伸縮振動(dòng)。1 640 cm-1的強(qiáng)吸收峰是—COOR或—CHO中的C=O鍵的伸縮振動(dòng),1 416～1 250 cm-1附近處的吸收峰是由C—O伸縮振動(dòng)引起的。1 250 cm-1附近有一個(gè)強(qiáng)的吸收峰是由不對(duì)稱的S=O鍵伸縮振動(dòng)引起的。830 cm-1左右處有一個(gè)對(duì)稱的C—O—S拉伸振動(dòng)引起的吸收峰。588 cm-1附近處是由O—S—O的不對(duì)稱引起的變形。

同時(shí)對(duì)比保護(hù)仲、伯羥基的紅外譜圖發(fā)現(xiàn)在1 716 cm-1和1 180 cm-1處的吸收峰是仲羥基保護(hù)基團(tuán)的O-三氟乙?；奶卣魑辗?1 360 cm-1和1 154 cm-1附近出現(xiàn)了甲氧基中的甲基和氧的吸收峰。這些結(jié)果表明,DHPD實(shí)現(xiàn)了定位硫酸化修飾。

2.3 硫酸化多糖對(duì)Amadori產(chǎn)物形成的影響

Amadori 作為糖基化反應(yīng)的早期產(chǎn)物,能與 NBT 在堿性條件下發(fā)生顏色反應(yīng),在530 nm 處有最大吸收。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),硫酸化衍生物對(duì)該過(guò)程的干預(yù)作用如圖2所示。

圖2 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD對(duì)Amadori產(chǎn)物的影響

在0～7 d內(nèi),抑制率大幅度增加,說(shuō)明6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD對(duì)Amadori產(chǎn)物的形成起到了抑制作用。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),抑制率不斷增強(qiáng),在第21天達(dá)到最大值,其中,6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的抑制率分別達(dá)到了87.84%、84.93%。由此可以看出,2種硫酸化多糖能明顯抑制糖基化早期Amadori產(chǎn)物的形成。

2.4 硫酸化多糖對(duì)二羰基化合物形成的影響

糖基化中期,Amadori產(chǎn)物經(jīng)氧化、水解降解成乙二醛、甲基乙二醛和脫氧葡萄糖醛酮等二羰基化合物。這些中間產(chǎn)物能夠與吉拉德-T試劑作用,生成的腙類化合物在294 nm 處有最大吸收。6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD對(duì)二羰基化合物形成的影響如圖3所示。

由圖3可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD對(duì)二羰基化合物形成的抑制作用不斷增強(qiáng),培養(yǎng)28 d后,高劑量的6-O-SDHPD與2,2′,4-O-SDHPD對(duì)二羰基化合物形成的抑制率相似,約為25%。

圖3 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD對(duì)二羰基化合物形成的影響

2.5 硫酸化多糖對(duì)AGEs產(chǎn)物形成的影響

糖基化晚期,二羰基化合物與葡萄糖相比更容易與游離的氨基發(fā)生反應(yīng),通過(guò)氧化、水解和環(huán)化,形成不可逆的、具有熒光性質(zhì)的、與蛋白質(zhì)等大分子有交聯(lián)性的糖基化終產(chǎn)物AGEs。結(jié)果表明,2種多糖硫酸化衍生物對(duì)AGEs形成均具有一定的作用,如圖4所示。培養(yǎng)到第28天時(shí),高劑量的6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的抑制率分別為45.6%和42.1%。

圖4 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD對(duì)AGEs產(chǎn)物形成的影響

3 結(jié) 論

本研究對(duì)霍山石斛多糖進(jìn)行了定位硫酸化修飾,得到2種硫酸化多糖。研究發(fā)現(xiàn),2種多糖衍生物對(duì)蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)的3個(gè)階段均有一定的干預(yù)作用,表明硫酸化修飾的霍山石斛多糖對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的治療可能有潛在作用。