吳哲 李趙嘉 馮薇 孟然 王秀萍

摘要：為獲得快速和準確檢測蒲公英成分的提取工藝，以甲醇為提取劑，通過超聲波和酶解輔助提取，采用響應(yīng)面設(shè)計方法，結(jié)合指紋圖譜綜合質(zhì)量評價方法，篩選最佳提取工藝。結(jié)果表明，纖維素酶有利于提升提取和檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，液料比對提高提取率具有促進作用，甲醇與提取時間或甲醇與液料比對提取率的提升表現(xiàn)出了協(xié)同作用。高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析結(jié)果顯示，在所有的處理中，綠原酸和咖啡酸與對照圖譜匹配度均為100%，以二者含量為綜合評價指標，獲得的最佳提取條件為纖維素酶0.1%，pH值為4，液料比為300 ∶ 1（mL ∶ g），甲醇體積分數(shù)為40%，超聲提取時間120 min。本提取技術(shù)降低了操作成本，檢測結(jié)果穩(wěn)定，可直接用于實驗室蒲公英酚酸類成分檢測;同時，本研究中的提取優(yōu)化方法也為其他植物成分提取技術(shù)優(yōu)化提供了參考。

關(guān)鍵詞：蒲公英;指紋圖譜;咖啡酸;綠原酸;優(yōu)化及質(zhì)量評價

中圖分類號：R284.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0190-06

蒲公英是一種常見的中草藥，富含多糖、綠原酸、咖啡酸、總黃酮等多種活性成分。近年來隨著人們健康意識的提高，蒲公英逐漸成為一種藥食兼用植物。現(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英具有廣譜抑菌、抗氧化、抗腫瘤和免疫促進等作用，而這些作用與酚酸類物質(zhì)有一定的關(guān)系[1-2]。因此蒲公英不僅在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域備受關(guān)注，在食品特別是功能性食品的研究開發(fā)上也成為熱點。而酚酸類化合物的提取以及檢測則成為蒲公英應(yīng)用開發(fā)的重要基礎(chǔ)。

咖啡酸和綠原酸均為蒲公英的主要活性物質(zhì)[3]，且《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定蒲公英咖啡酸含量不應(yīng)低于0.02%。蒲公英成分含量變化除了與種類和栽培條件有關(guān)之外[4]，也與提取技術(shù)有關(guān)[1]。蒲公英成分提取方法按提取劑可分為水提和醇提，原理是酚酸物質(zhì)易溶于水和醇類溶劑。因此可將原料溶于提取劑，同時輔以物理方法或酶解方法破碎細胞壁，可提高酚酸成分提取率。提取工藝通常有熱水浸提、超聲波輔助提取、回流浸提等方法。影響提取率的因素還包括料液比、提取時間、提取溫度、溶劑濃度等，不同的提取條件有可能導(dǎo)致蒲公英成分結(jié)構(gòu)變化[1，3，5]，進而影響成分功效。因此如何平衡最大的提取率及提取質(zhì)量成為本研究的重點內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丹東蒲公英（Taraxacum antungense）葉片干粉為河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所選育的濱蒲1號葉片加工獲得。60 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過80目篩，粉末置干燥器中干燥保存、備用。

咖啡酸、綠原酸、阿魏酸及木樨草素標準品購自中國藥品生物制品檢定所;無水甲醇為國產(chǎn)分析純;纖維素酶酶活性為10 000 U/g;純化水由河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所制備。

1.2 提取工藝及優(yōu)化

稱取一定量蒲公英樣品，放入50 mL具塞離心管中，加入5 mL纖維素酶溶液（質(zhì)量濃度為0.1%，pH值為4），置于60 ℃水浴加熱30 min[1，6];隨后離心管中加入甲醇溶液20 mL，進行超聲提取，超聲波功率120 W，提取結(jié)束后離心取上清液，待測。優(yōu)化的參數(shù)為甲醇濃度、料液比以及提取時間，具體提取參數(shù)及蒲公英樣品質(zhì)量按響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計表進行（表1）。

1.3 檢測方法

利用注射器輔以0.45 μm濾膜將提取液注入進樣瓶，準備液相檢測。液相檢測條件為安捷倫 1 200 HPLC，鉆石1代C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流動相：A（0.02% 磷酸水溶液） ∶ B（甲醇）=50 ∶ 50;檢測波長：350 nm;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;進樣量：10 μL。

配制不同濃度的綠原酸和咖啡酸標品，與對應(yīng)的HPLC峰面積建立標準曲線，經(jīng)擬合后，標準曲線分別為y1=16.835x1-16.971、y2 =22.173x2-13.042。其中，y1、y2為綠原酸和咖啡酸峰面積;x1和x2為綠原酸和咖啡酸含量，μg/mL。有效檢測范圍為0～100 μg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

為了更好地評價提取工藝，將不同提取條件下的綠原酸和咖啡酸得率加權(quán)，以總咖啡酸得率為優(yōu)化目標[11]，利用Design Expert 8.0.6軟件綜合評價提取工藝。加權(quán)方法：以綠原酸和咖啡酸得率的算術(shù)平均值比值為系數(shù)（k），將綠原酸轉(zhuǎn)換為咖啡酸，可得總咖啡酸得率，經(jīng)計算k=0.544（表1），即：總咖啡酸得率=綠原酸得率（%）×0.544+咖啡酸得率（%）。最后將HPLC數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，進行相似度分析。試驗每個處理重復(fù)4次，結(jié)果以平均數(shù)±標準誤形式呈現(xiàn)，采用SPSS 16.0軟件Duncans新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡酸提取工藝優(yōu)化

試驗結(jié)果表明，Cubic模型擬合結(jié)果呈顯著性（F=6.855，P=0.039），但是部分交叉項超出可信范圍，調(diào)整后模型變?yōu)閥=5.710-0.410x1+0.740x2-0.190x3+0.078x1x2-0.480x1x3+0.048x2x3-0.140x21-0.800x22+0.260x23-0.660x21x2+1.170x21x3+1.880x1x22，R2=0.95，其中y為咖啡酸含量，x1、x2、x3為甲醇含量，液料比和時間。根據(jù)模型的方差分析（表2），從單因子影響結(jié)果看，液料比顯著促進提取率（F=9.416，P=0.037），其他2個因素對提取率沒有顯著影響，影響力大小為液料比>甲醇含量>時間。從影響因子協(xié)同效果看，甲醇含量與時間（A2C，F(xiàn)=11.536，P=0.027），甲醇含量與液料比（AB2，F(xiàn)=29.85，P=0.006）協(xié)同作用均對提取率有顯著促進作用。根據(jù)實際數(shù)值，擬合函數(shù)為 y= 0.884 28x1+ 0.221 73x2+ 0.361 80x3-0.001 71x1x2-0.013 38x1x3+0.000 01x2x3-0.003 35x21-0.000 77x22+0.000 13x23-0.000 03x21x2+0.000 12x21x3+ 0.000 01x1x22-36.276 06。據(jù)此，可獲得10個最高提取率的方案（表3），其中優(yōu)化后的甲醇濃度主要圍繞在40%和70%，提取時間主要圍繞在120 min，液料比主要圍繞在200 ∶ 1（mL ∶ g）和300 ∶ 1（mL ∶ g）。由表3可知，最高提取率的方案為甲醇濃度40%，液料比200.7 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間 120 min，預(yù)期咖啡酸含量7.7 mg/g。

2.2 綠原酸提取工藝優(yōu)化

利用同樣的分析及處理方法，對綠原酸提取工藝進行優(yōu)化，可得到擬合模型，即y=3.059-0.107x1+0.255x2+0.005x3+0.055x1x2-0.075x1x3+0.004x2x3-0.055x21-0.196x22-0.019x23-0.122x21x2+0.228x21x3+0.356x1x22，R2=0.98，其中y為咖啡酸含量，x1、x2、x3為甲醇濃度，液料比和時間。根據(jù)模型結(jié)果和方差分析（表4）可知，甲醇濃度（F=9.660，P=0.036 0）和液料比（F=54.960，P=0.002 0）均對綠原酸提取率有顯著促進作用，甲醇濃度與時間（A2C，F(xiàn)=22.010，P=0.009 0），甲醇濃度與液料比（x1x22，F(xiàn)=53.550，P=0.002 0）協(xié)同作用均對提取率有顯著促進作用。根據(jù)優(yōu)化模型，可獲得10個最高提取率的方案（表5），其中優(yōu)化后的甲醇濃度主要為40%、70%，提取時間約為 120 min，而液料比約為200 ∶ 1（mL ∶ g）和300 ∶ 1（mL ∶ g），最高提取率的方案為甲醇濃度40%，液料比 203.7 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間120.0 min，預(yù)期綠原酸含量為3.40 mg/g。

2.3 總酚酸提取工藝優(yōu)化

對咖啡酸和綠原酸加權(quán)處理后?利用同樣的分析方法，對總酚酸提取工藝進行優(yōu)化，可得到擬合模型，即y=7.374 0-0.472 5x1+0.885 0x2-0.190 0x3+0.107 5x1x2-0.522 5x1x3+0.050 0x2x3-0.167 0x21-0.909 5x22+0.250 5x23-0.732 5x21x2+1.287 5x21x3+2.065 0x1x22，R2=0.96，其中y為咖啡酸含量，x1、x2、x3為甲醇濃度，液料比和時間。根據(jù)模型結(jié)果和方差分析可知，液料比（F=11.610，P=0.027 1）對總酚酸提取率有顯著性促進作用，甲醇濃度與時間（A2C，F(xiàn)=12.290，P =0.025 0），甲醇濃度與液料比（AC，F(xiàn)=31.620，P =0.005 0）協(xié)同作用均對提取率有顯著促進作用（表6）。根據(jù)模型可得到10個最高提取率的方案，其中優(yōu)化后的甲醇濃度約為40%、70%，提取時間約為120.0 min，液料比約為200.0 ∶ 1、300.0 ∶ 1（mL ∶ g）。由表7可知，最高提取率方案為甲醇濃度40%，液料比202.7 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間 120.0 min，預(yù)期總酚酸含量為9.55 mg/g。

2.4 總成分提取工藝指紋圖譜分析與聚類分析

將所有提取液的HPLC數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)中，經(jīng)數(shù)據(jù)匹配，以中位數(shù)法建立對照指紋圖譜（圖1、表8）。結(jié)果顯示所有峰的保留時間RSD均小于1%，說明所有的提取工藝一致性較好。蒲公英樣品共檢測出10種成分，其中所有提取方法均檢測出綠原酸（4號）和咖啡酸（8號），二者為共有成分，與對照圖譜匹配度為100%。其他成分1號、5號、9號匹配度也較高，經(jīng)標準品檢測和文獻查閱，這3種成分為七葉內(nèi)酯[3，7]、木樨草素-7-O-β-D葡萄糖苷[3，7]和阿魏酸。通過指紋圖譜相似度分析，所有的提取工藝之間相似度均在0.98以上，說明所有的提取工藝在質(zhì)量上具有高度相似性。為了更好地篩選提取工藝，筆者以咖啡酸和綠原酸峰面積為聚類指標，應(yīng)用SPSS分析軟件，采用組間聯(lián)結(jié)、歐氏聚類法，所有提取工藝的聚類分析結(jié)果見圖2。

當閾值為10時，所有的提取工藝被劃分為兩大類，其中10號處理被單列為一類，其他16種處理被劃為一大類。隨著閾值的減小，所有提取工藝可分為5類，其中處理5為單獨一類。結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化模型給出的方案可知，處理5提取率最高，其次為處理2、處理3、處理4、處理6、處理8、處理9、處理12、處理17。

2.5 提取工藝篩選與驗證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化模型，本研究獲得3個最高提取率的條件，這3個條件非常相近，因此可確定優(yōu)選條件（Ⅰ）為甲醇濃度40%，液料比200 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間 120 min。同時結(jié)合聚類分析結(jié)果，筆者選擇提取率相對中等（Ⅱ）和低水平（Ⅲ）的2個條件，分別為甲醇濃度70%，液料比300 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間120 min;甲醇濃度60%，液料比300 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間30 min;提取結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示試驗結(jié)果與軟件模擬計算結(jié)果差異不顯著，說明優(yōu)化模型預(yù)測結(jié)果可信。另外，優(yōu)選條件Ⅰ的咖啡酸提取率顯著高于條件Ⅲ，但與條件Ⅱ差異不顯著（P=0.785），說明優(yōu)選條件Ⅰ和Ⅱ均可作為最佳提取工藝。

2.6 纖維素酶及離心操作對提取及檢測結(jié)果的影響

本試驗優(yōu)化工藝篩選是基于加酶輔以超聲波提取，由于水浴過程中可能存在酶解不完全或水分損失問題，因此筆者考察纖維素酶以及離心操作后二次定容對檢測結(jié)果的影響。由于咖啡酸是《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定的參考標準，因此筆者在優(yōu)選條件Ⅱ下比較了不同操作咖啡酸檢測結(jié)果（表9）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是否離心，加酶偏差最小，說明加酶后可提高該工藝的穩(wěn)定性。離心定容后咖啡酸含量均降低，說明二次定容帶來的絕對誤差加大，因此本研究中的提取及檢測不需要二次定容，須注意水浴過程中盡可能避免水分損失。

3 結(jié)論與討論

目前商業(yè)生產(chǎn)中蒲公英成分提取多采用水提法，是因為考慮到提取劑成本以及提取設(shè)備復(fù)雜程度相對較低[1]，而小規(guī)模提取多采用乙醇溶劑提取[5-6，8]，是因為酚酸物質(zhì)更易溶于醇類溶劑。本研究采用甲醇為溶劑，是因為酚酸物質(zhì)檢測多用HPLC檢測方法，如GB/T 22250—2008《保健食品中綠原酸的測定》以及《中華人民共和國藥典》2015年版等。甲醇由于極性好，常用于HPLC流動相。因此本研究直接用甲醇提取，省略了乙醇提取物旋蒸發(fā)+甲醇二次溶解步驟[4，8-10]，不僅降低了液相進樣的前處理時間，提高了檢測效率，也減少了試驗操作誤差，提高了檢測準確率。

已發(fā)表文獻中蒲公英樣品質(zhì)量多在1 g左右，液料比常見于（10～30） ∶ 1（mL ∶ g）之間[1，2，9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，液料比過低容易使溶解不充分，影響提取效果。本研究中干樣品質(zhì)量約為0.1 g，甲醇 25 mL，降低材料成本。另外從指紋圖譜可知，蒲公英主要物質(zhì)在15 min內(nèi)即可檢出，因此在用液相色譜檢測蒲公英咖啡酸和綠原酸時，可將檢測時間控制在 15 min 內(nèi)，從而降低了檢測時間成本。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，在酶解+超聲波輔助提取條件下，如果從節(jié)約成本的角度，本研究推薦優(yōu)化條件 Ⅰ，即甲醇40%、液料比200 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間120 min;如果考慮提取率和綜合質(zhì)量，則選擇優(yōu)化條件 Ⅱ，即甲醇70%，液料比300 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間120 min。

目前關(guān)于蒲公英有效成分提取技術(shù)優(yōu)化研究主要集中在提高某一種成分提取率或浸出物總提取率方面;在用于提取質(zhì)量評價的指標篩選過程中，筆者利用指紋圖譜分析，采用多指標評價了提取質(zhì)量，這對評價成分復(fù)雜的中藥材，具有一定的科學(xué)合理性[11]。本研究為綜合評價中藥材質(zhì)量提供了一種思路，即可根據(jù)各成分在藥效中所起的作用賦予不同的權(quán)重系數(shù)綜合評分進行評價，避免了對多指標單獨評價時相互間的沖突。同時本研究的提取優(yōu)化方法也為其他植物成分提取技術(shù)優(yōu)化提供了參考。

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