施天元 程玉祥

摘要：小檗堿橋酶（berberine bridge enzyme，簡(jiǎn)稱BBE）是一類典型的黃素雙共價(jià)氧化酶家族，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)生物過(guò)程。PtBBE9a是筆者所在課題組前期從楊樹(shù)發(fā)育木質(zhì)部分離、鑒定的糖蛋白。PtBBE9a基因表達(dá)在楊樹(shù)木質(zhì)部呈現(xiàn)高豐度水平，并且隨著莖木質(zhì)化程度的增強(qiáng)而升高。組織β-葡萄糖苷酸酶（GUS）活性染色結(jié)果顯示，PtBBE9a啟動(dòng)子活性集中在ProPtBBE9a：：GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的頂端分生組織、成熟果莢皮及根組織。通過(guò)構(gòu)建PtBBE9a-GFP過(guò)表達(dá)載體發(fā)現(xiàn)，PtBBE9a過(guò)表達(dá)擬南芥比野生型擬南芥早開(kāi)花。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片數(shù)少于野生型擬南芥，而其莖木質(zhì)素含量高于野生型擬南芥。推測(cè)PtBBE9a可能通過(guò)調(diào)控?cái)M南芥生長(zhǎng)發(fā)育周期而產(chǎn)生早花表型。

關(guān)鍵詞：楊樹(shù);PtBBE9a基因;異源過(guò)表達(dá);啟動(dòng)子;轉(zhuǎn)基因擬南芥;BBE

中圖分類號(hào)： S718.43 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）23-0066-05

小檗堿橋酶（berberine bridge enzyme，簡(jiǎn)稱BBE）是一類典型的黃素雙共價(jià)氧化酶家族[1]。BBE家族的所有成員均有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合域（a/b結(jié)合域）[2]。BBE最先被報(bào)道參與生物堿合成[3-4]，隨后人們發(fā)現(xiàn)了BBE的不同功能，如參與免疫反應(yīng)與脅迫響應(yīng)[5-6]、受激素調(diào)控[7-9]、參與雌雄配子體發(fā)育和花粉管伸長(zhǎng)等[10-12]。Daniel等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的BBE蛋白具有木質(zhì)素氧化酶特性，可氧化松柏醇、β-糖苷松柏醇等木質(zhì)素單體，參與木質(zhì)素生物合成[13]。

楊樹(shù)BBE家族有69個(gè)成員，分為A～F 6個(gè)亞型[14]。筆者在前期研究并鑒定楊樹(shù)發(fā)育過(guò)程中的木質(zhì)部糖蛋白組時(shí)，識(shí)別到11個(gè)PtBBEs（未發(fā)表），PtBBE9a是其中之一。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PtBBE9a與擬南芥單木質(zhì)素氧化酶AtBBE-like 13是對(duì)應(yīng)基因。本研究通過(guò)分析PtBBE9a在組織內(nèi)的表達(dá)水平和其啟動(dòng)子活性，旨在著重解析PtBBE9a在模式植物擬南芥中的異源過(guò)表達(dá)功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在2018年10月取生長(zhǎng)于東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫室內(nèi)的毛果楊（Populus trichocarpa）幼樹(shù)（6月齡）的各個(gè)組織和莖節(jié)，用于轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)分析。將溫室栽培45 d的苗期、開(kāi)花盛期的擬南芥用于農(nóng)桿菌浸花法遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2 主要試劑

pBIOZOL Plant Total RNA Extraction Reagent（Bioflux）;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒[PrimeScript RT reagent Kitt with gDNA eraser（購(gòu)自Takara公司）];pENTR/SD/D-TOPO、Gateway LR酶（購(gòu)自Invitrogen公司）;膠回收試劑盒[Silica Bead DNA Gel Extrction Kit（購(gòu)自Thermo Scientific公司）];KOD-Plus高保真酶（購(gòu)自Toyobo公司）;X-Gluc、乙酰溴（購(gòu)自Sigma公司）。GUS染液配方：1 mg/mL X-Gluc，10 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸），100 mmol/L Na3PO4（磷酸鈉），2 mmol/L K3Fe（CN）6（鐵氰化鉀），2 mmol/L K4Fe（CN）6（亞鐵氰化鉀），0.1% Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物RNA的提取和cDNA的合成 在液氮條件下把毛果楊各個(gè)組織、莖節(jié)及擬南芥葉片材料研磨成粉末，加入pBIOZOL植物RNA提取試劑，提取具體操作參照pBIOZOL Plant Total RNA Kit說(shuō)明書。cDNA的合成參照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser操作說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 20 μL RT-PCR反應(yīng)體系：13.5 μL 去離子無(wú)菌水，2.0 μL dNTP，2.0 μL 10×Buffer，0.5 μL Taq DNA聚合酶，各0.5 μL引物，1.0 μL cDNA模板。RT-PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，24～35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。50 μL全長(zhǎng)基因和啟動(dòng)子擴(kuò)增體系：32.0 μL去離子無(wú)菌水，5.0 μL dNTP Mix（2 mmol/L），5.0 μL 10×PCR buffer，2.0 μL MgSO4（25 mmol/L），1.0 μL KOD-plus，各1.5 μL引物，2.0 μL模板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.3.3 ProPtBBE9a：：GUS 和35S：：PtBBE植物表達(dá)載體的構(gòu)建 用PtBBE9a-Pro-up/down引物擴(kuò)增PtBBE9a基因啟動(dòng)子片段;回收后連接至pENTR/SD/D-TOPO載體上，再用該載體轉(zhuǎn)化TOP10;挑選出陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)LR交換連接到pGWB3上，將后者轉(zhuǎn)化入GV3101農(nóng)桿菌中。用PtBBE9a-up/down引物擴(kuò)增PtBBE9a基因片段，再將其連接至pENTR/SD/D-TOPO載體上，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒，經(jīng)LR交換構(gòu)建到pGWB5植物過(guò)表達(dá)載體上。

1.3.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌浸花法[15]。轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子鑒定包括2個(gè)方面：用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入PtBBE9a基因的轉(zhuǎn)錄水平;用Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)入PtBBE9a基因的蛋白質(zhì)水平，一抗為anti-GFP抗體，具體操作方法參考Liu等的報(bào)道[16]。

1.3.5 GUS染色檢測(cè) 將ProPtBBE9a：：GUS各組織材料放入離心管中，加入GUS染液使其沒(méi)過(guò)植物材料，放入真空干燥器里抽氣，重復(fù)數(shù)次至植物材料沉至管底。取出植物材料后于37 ℃過(guò)夜反應(yīng)，再分別用100%、90%、70%乙醇逐級(jí)脫去葉綠素。

1.3.6 擬南芥開(kāi)花時(shí)間及葉片數(shù)統(tǒng)計(jì) 當(dāng)擬南芥莖抽出1 cm時(shí)，統(tǒng)計(jì)時(shí)間和蓮座葉數(shù)量。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系統(tǒng)計(jì)15個(gè)植株，重復(fù)3次，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.7 木質(zhì)素含量的測(cè)定 稱取1 mg擬南芥莖組織粉末，木質(zhì)素含量的測(cè)定參照Foster等的改良測(cè)定方法[17]。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 采用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)開(kāi)花時(shí)間、開(kāi)花時(shí)葉片數(shù)和莖組織木質(zhì)素含量等數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（ANOVA）。

1.3.9 引物序列 本研究所用引物及其序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtBBE9a基因的表達(dá)分析

提取毛果楊木質(zhì)部、形成層、韌皮部、頂芽、幼葉、老葉、葉柄和第1～6、9、12莖節(jié)總RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用PtActin2內(nèi)標(biāo)基因?qū)Ω鹘M織內(nèi)的cDNA進(jìn)行定量，RT-PCR分析結(jié)果顯示，PtBBE9a能在木質(zhì)部特異性表達(dá)且轉(zhuǎn)錄水平較高，在形成層和老葉中也有少量轉(zhuǎn)錄（圖1-a）。第1、2莖節(jié)中PtBBE9a的轉(zhuǎn)錄水平極低，第3、4、5、6、9莖節(jié)中的轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加，第12莖節(jié)中的轉(zhuǎn)錄水平極高（圖1-b）。這表明隨著毛果楊莖逐步木質(zhì)化，PtBBE9a的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高。

2.2 ProPtBBE9a：：GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建

為了鑒定PtBBE9a基因啟動(dòng)子的活性，構(gòu)建其驅(qū)動(dòng)表達(dá)GUS報(bào)告基因的pGWB3植物表達(dá)載體。經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到3 287bp的PtBBE9a啟動(dòng)子片段（圖2-a），將其連接到pENTR/SD/D-TOPO載體上（圖2-b），通過(guò)LR交換反應(yīng)，將PtBBE9a啟動(dòng)子片段同源重組到pGWB3載體上，得到ProPtBBE9a：：GUS融合質(zhì)粒（圖2-c），將其轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌，用于擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.3 ProPtBBE9a：：GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥組織GUS活性染色

通過(guò)對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得12個(gè)ProPtBBE9a∷GUS轉(zhuǎn)基因株系。苗齡為5、10 d的幼苗染色結(jié)果顯示，GUS活性出現(xiàn)在頂端分生組織（圖3-a～圖3-c）。在開(kāi)花的ProPtBBE9a∷GUS轉(zhuǎn)基因植株中，在果莢基部、成熟果莢皮上均檢測(cè)到GUS染色（圖3-d～圖3-e）。另外，在成熟的植株根部也檢測(cè)到GUS染色（圖3-f）。這些結(jié)果提示，ProPtBBE9a啟動(dòng)子活性集中在擬南芥幼苗的頂端分生區(qū)和維管系統(tǒng)較發(fā)達(dá)的根組織。

2.4 PtBBE9a過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及其在擬南芥中的異源過(guò)表達(dá)

為了鑒定PtBBE9a的功能，筆者構(gòu)建了pGWB5-PtBBE9a植物過(guò)表達(dá)載體。以毛果楊木質(zhì)部組織cDNA為模板，擴(kuò)增出了PtBBE9a基因的全長(zhǎng)片段（圖4-a），將該基因片段連接到pENTR/SD/D-TOPO載體上（圖4-b），采用LR交換反應(yīng)得到 35S∷PtBBE9a-GFP 融合質(zhì)粒（圖4-c），再用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌，用于擬南芥過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化。

采用農(nóng)桿菌浸花法將35S∷PtBBE9a-GFP轉(zhuǎn)化入擬南芥中，獲得12個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系（編號(hào)為1#～12#）。提取野生型和12個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的總RNA并合成cDNA，用RT-PCR檢測(cè)各株系PtBBE9a-GFP的轉(zhuǎn)錄水平（圖5-a）。與內(nèi)參基因AtActin2相比，2#、5#、10#、12#株系中PtBBE9a的轉(zhuǎn)錄水平極高，表明這4個(gè)株系達(dá)到了PtBBE9a的過(guò)表達(dá)水平。隨后，通過(guò)Western檢測(cè)分析轉(zhuǎn)基因株系的PtBBE9a-GFP蛋白質(zhì)水平（圖5-b）。以Actin蛋白量為參照的分析結(jié)果顯示，2#、5#、10#、12# 株系中的PtBBE9a-GFP蛋白質(zhì)含量非常高，表明這4個(gè)株系的PtBBE9a蛋白質(zhì)量達(dá)到了過(guò)表達(dá)水平。

2.5 過(guò)表達(dá)PtBBE9a擬南芥早開(kāi)花

筆者選取PtBBE9a過(guò)表達(dá)量最高的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（2#、5#、12#）的鑒定表型，發(fā)現(xiàn)3個(gè)過(guò)表達(dá)株系擬南芥均比野生型擬南芥呈現(xiàn)出早開(kāi)花表型（圖6-a），野生型擬南芥生長(zhǎng)至抽薹的平均時(shí)間為23.87 d，3個(gè)過(guò)表達(dá)株系生長(zhǎng)至抽薹的平均時(shí)間分別是21.53、21.00、19.07 d。進(jìn)一步觀察過(guò)表達(dá)株系發(fā)育狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，抽薹時(shí)野生型擬南芥蓮座葉數(shù)量平均為12.87張，3個(gè)過(guò)表達(dá)株系的蓮座葉數(shù)量分別為11.40、10.93、9.73張（圖6-b），表明PtBBE9a過(guò)表達(dá)導(dǎo)致擬南芥植株的生長(zhǎng)發(fā)育周期縮短。為了探究PtBBE9a過(guò)表達(dá)帶來(lái)的早開(kāi)花功能，筆者測(cè)定了3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的莖部木質(zhì)素含量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株莖部木質(zhì)素含量均高于野生型植株（圖6-c）。

3 討論

早期被報(bào)道的BBE家族功能是參與生物堿合成，最新的研究發(fā)現(xiàn)，BBE有木質(zhì)素單體氧化酶活性[13]。PtBBE9a是筆者在前期研究中從楊樹(shù)木質(zhì)部糖蛋白組中分離出來(lái)的（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。本研究發(fā)現(xiàn)，PtBBE9a在毛果楊木質(zhì)部呈現(xiàn)出特異性轉(zhuǎn)錄水平，在ProPtBBE9a∷GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥中，PtBBE9a啟動(dòng)子的活性主要體現(xiàn)在頂端分生組織和成熟根部，這些組織是植物次生維管系統(tǒng)較發(fā)達(dá)的組織，暗示PtBBE9a很可能與細(xì)胞壁的木質(zhì)素代謝相關(guān)。

過(guò)表達(dá)PtBBE9a擬南芥出現(xiàn)早花表型，該發(fā)現(xiàn)在植物BBE功能研究中尚未報(bào)道。研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因PtBBE9a擬南芥的連座葉數(shù)量變少，表明轉(zhuǎn)基因縮短了擬南芥的生長(zhǎng)周期，使其比野生型早開(kāi)花。另外，過(guò)表達(dá)PtBBE9a的擬南芥莖部木質(zhì)素含量明顯高于野生型。木質(zhì)素水平升高很可能會(huì)加速植物維管組織系統(tǒng)成熟，可能增強(qiáng)了葉片成花素（FT）的運(yùn)輸。過(guò)表達(dá)糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的煙草會(huì)早花，木質(zhì)素含量會(huì)升高[18]，而過(guò)表達(dá)細(xì)胞壁擴(kuò)張蛋白也會(huì)導(dǎo)致植物早花[19]。推測(cè)植物維管系統(tǒng)細(xì)胞壁狀態(tài)可能與早開(kāi)花密切相關(guān)，而木質(zhì)素是次生細(xì)胞壁的關(guān)鍵成分，它影響次生維管系統(tǒng)的發(fā)育成熟。今后，筆者將利用過(guò)表達(dá)PtBBE9a擬南芥早花材料進(jìn)行深入探究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Daniel B，Konrad B，Toplak M，et al. The family of berberine bridge enzyme-like enzymes：a treasure-trove of oxidative reactions[J]. Arch Biochem Biophys，2017，632：88-103.

[2]Winkler A，Lyskowski A，Riedl S，et al. A concerted mechanism for berberine bridge enzyme[J]. Nat Chem Biol，2008，4（12）：739-741.

[3]Winkler A，Puhl M，Weber H，et al. Berberine bridge enzyme catalyzes the six electron oxidation of（S）-reticuline to dehydroscoulerine[J]. Phytochemistry，2009，70（9）：1092-1097.

[4]Winkler A，Hartner F，Kutchan T M，et al. Biochemical evidence that berberine bridge enzyme belongs to a novel family of flavoproteins containing a bi-covalently attached FAD cofactor[J]. J Biol Chem，2006，281（30）：21276-21285.

[5]Klok E J，Wilson I W，Wilson D，et al. Expression profile analysis of the low-oxygen response in Arabidopsis root cultures[J]. Plant Cell，2002，14（10）：2481-2494.

[6]Li W X，Oono Y，Zhu J，et al. The Arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promote drought resistance[J]. Plant Cell，2008，20（8）：2238-2251.

[7]Goda H，Sawa S，Asami T，et al. Comprehensive comparison of auxin-regulated and brassinosteroid-regulated genes in Arabidopsis[J]. Plant Physiol，2004，134（4）：1555-1573.

[8]Redman J C，Haas B J，Tanimoto G，et al. Development and evaluation of an Arabidopsis whole genome Affymetrix probe array[J]. Plant J，2004，38（3）：545-561.

[9]Rashotte A M，Carson S D，To J P，et al. Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis[J]. Plant Physiol，2003，132（4）：1998-2011.

[10]Becker J D，Boavida L C，Carneiro J，et al. Transcriptional profiling of Arabidopsis tissues reveals the unique characteristics of the pollen transcriptome[J]. Plant Physiol，2003，133（2）：713-725.

[11]Johnston A J，Meier P，Gheyselinck J，et al. Genetic subtraction profiling identifies genes essential for Arabidopsis reproduction and reveals interaction between the female gametophyte and the maternal sporophyte[J]. Genome Biol，2007，8（10）：R204.

[12]Wuest S E，Vijverberg K，Schmidt A，et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes[J]. Curr Biol，2010，20（6）：506-512.

[13]Daniel B，Pavkov-Keller T，Steiner B，et al. Oxidation of monolignols by members of the berberine bridge enzyme family suggests a role in plant cell wall metabolism[J]. J Biol Chem，2015，290（30）：18770-18781.

[14]施天元. 毛果楊BBE基因家族及部分基因的功能解析[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2020.

[15]Clough S J，Bent A F. Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant J，1998，16（6）：735-743.

[16]Liu J W，Zhou W B，Liu G F，et al. The conserved endoribonuclease YbeY is required for chloroplast ribosomal RNA processing in Arabidopsis[J]. Plant Physiol，2015，168（1）：205-221.

[17]Foster C E，Martin T M，Pauly M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls （lignocellulosic biomass） part Ⅰ：lignin[J]. J Vis Exp，2010，37：e1745.

[18]Wang Y W，Wang W C，Jin S H，et al. Over-expression of a putative poplar glycosyltransferase gene，PtGT1，in tobacco increases lignin content and causes early flowering[J]. Exp Bot，2012，63（7）：2799-2808.

[19]Xiao C，Barnes W J，Zamil M S，et al. Activation tagging of Arabidopsis POLYGALACTURONASE INVOLVED IN EXPANSION2 promotes hypocotyl elongation，leaf expansion，stem lignification，mechanical stiffening，and lodging[J]. Plant J，2017，89（6）：1159-1173.荊玲俠，卜朝陽(yáng)，崔學(xué)強(qiáng)，等. 素馨屬植物ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（23）：71-79.