王佳鑫，曹 宇，李 雯，葛玉松，付守鵬，柳巨雄

(吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春130062)

乳腺是哺乳動物哺育后代的唯一器官，乳腺的發(fā)育程度直接決定幼畜的生長狀況[1]。乳腺發(fā)育經(jīng)歷了幾個不同的時期，包括胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期,其乳導(dǎo)管分支及終末端的形成主要發(fā)生于青春期[2]。而乳腺腺泡細(xì)胞的分化及泌乳的啟動主要發(fā)生于妊娠期和泌乳期。因此，青春期乳腺的發(fā)育程度直接決定了泌乳期腺泡細(xì)胞的數(shù)量[3-4]。

乳腺組織的發(fā)育受到許多激素和生長因子的調(diào)控，此外，乳腺發(fā)育也受到脂肪酸的影響[5-6]。據(jù)報道，高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖減少，乳腺發(fā)育受阻[7]。添加油酸可促進(jìn)青春期小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳腺發(fā)育[8]。由此可見脂肪酸在乳腺發(fā)育中起重要作用。月桂酸主要存在于椰子油(45%～52%)和棕籽油(44%～52%)中。已有報道，月桂酸有良好的抗菌作用且有利于燒傷組織的再生，并可預(yù)防由睪酮引起的大鼠前列腺增生[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加月桂酸可影響大鼠乳汁中脂肪酸的分泌，哺乳期母鼠飼糧中添加月桂酸可增加子代小鼠平均體質(zhì)量[11-12]。因此我們推測，月桂酸可能通過影響乳腺發(fā)育從而改變泌乳。本研究通過體外向mMECs中添加月桂酸和體內(nèi)飼喂月桂酸的方式，研究月桂酸對青春期小鼠乳腺發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理將mMECs在含有10%FBS的DMEM中于5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng),然后添加不同濃度的月桂酸(0，50，100，150，200 μmol/L)培養(yǎng)1 d。

1.2 CCK-8法將mMECs與月桂酸孵育2 d后，使用CCK8試劑盒檢測mMECs的增殖。 將mMECs在37℃下與每個孔中的10 μL CCK8孵育1 h后，用450 nm酶標(biāo)儀測量吸光度。

1.3 免疫印跡分析使用RIPA裂解緩沖液分離出mMECs和小鼠乳腺的總蛋白，用PierceTMBCA蛋白測定試劑盒確定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離總蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜與一抗(1∶1 000稀釋)在4℃下孵育過夜，然后用HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠(1∶3 000)或山羊抗兔(1∶3 000)二抗在室溫下孵育1 h ，用ECL Plus超敏發(fā)光溶液可視化蛋白質(zhì)條帶。

1.4 流式細(xì)胞儀分析將mMECs用胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，在4℃下用1 mL預(yù)冷的70%酒精固定12 h，離心3～5 min，除去上清液，保留約50 μL 70%乙醇。加入1 mL預(yù)冷的PBS并將細(xì)胞重懸，離心細(xì)胞，小心除去上清液并保留50 μL PBS。 輕彈管的底部以分散細(xì)胞， 向每個樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色溶液，將細(xì)胞緩慢完全懸浮，并在黑暗中于37℃保持30 min。使用流式細(xì)胞儀(BD LSRFortessaTM)檢測細(xì)胞周期。

1.5 全組織染色分析通過頸脫位法處死小鼠，打開皮膚，暴露乳腺，摘取乳腺并鋪在經(jīng)4%多聚賴氨酸處理的載玻片上，卡諾氏液固定過夜。將乳腺浸入70%,35%和15%的乙醇中10 min，室溫下用胭脂紅明礬(2 g / L)染色過夜。染色后將載玻片在酒精中漂洗10 min，浸入二甲苯中使用立體顯微鏡觀察。

1.6 動物和體內(nèi)試驗所有動物試驗和護(hù)理程序均按照吉林大學(xué)動物保護(hù)福利規(guī)程進(jìn)行。將出生4周的小鼠分為對照組(喂食對照飲食，n=6)和月桂酸組(飲用水含0.05%,0.10%和1.00%的月桂酸，n=6)，4周后處死小鼠并收集第4對乳腺。將左乳腺冷凍在-80℃用于進(jìn)一步分析，右乳腺用于組織染色。

1.7 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。 使用t檢驗和單因素方差分析確定均值之間的差異，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 月桂酸對細(xì)胞增殖的影響CCK8法檢測不同濃度月桂酸對mMECs增殖率的影響，結(jié)果表明100 μmol/L月桂酸能顯著增加mMECs的增殖率，而50,150和200 μmol/L月桂酸對mMECs增殖沒有顯著性影響(圖1)。

圖1 不同濃度月桂酸對mMECs增殖的影響

2.2 月桂酸對細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響Western blot法檢測不同濃度月桂酸對mMECs中細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響，結(jié)果表明，100 μmol/L月桂酸能顯著增加mMECs中Cyclin D1、Cyclin D3和PCNA的表達(dá)量(圖2)。

圖2 不同濃度月桂酸對細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響

2.3 月桂酸對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響流式細(xì)胞儀檢測月桂酸對細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明，100 μmol/L月桂酸可顯著增加S期細(xì)胞，并顯著減少G1/G0期細(xì)胞(圖3)。

圖3 100 μmol/L月桂酸對細(xì)胞周期的影響

2.4 月桂酸通過ERK信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)有研究表明，ERK1/2信號通路在細(xì)胞增殖過程中具有重要作用。因此，我們使用ERK1/2的抑制劑U0126探討ERK1/2信號通路在月桂酸促進(jìn)mMECs增殖標(biāo)志物中的作用。結(jié)果表明，月桂酸能顯著增加了p-Rb/Rb的比值 (圖4A,E)，而U0126可完全阻斷月桂酸促進(jìn)細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的作用(圖4A,C,D)，并阻斷增加p-Rb/Rb比值的作用 (圖4A,E)。

2.5 乳導(dǎo)管及終末端的檢測通過胭脂紅染色法檢測了含有不同濃度月桂酸的飲用水(0.00%,0.05%,0.10%和1.00%)對青春期小鼠乳導(dǎo)管分支及終末端數(shù)量的影響,結(jié)果表明，飲用水中包含0.05%月桂酸能顯著增加青春期小鼠乳導(dǎo)管分支及終末端數(shù)量(圖5)。

2.6 飼喂月桂酸對青春期小鼠乳腺中細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響Western blot法檢測了乳腺中Cyclin D1、CyclinD3和PCNA的表達(dá)量,結(jié)果表明，0.05%月桂酸顯著增加了青春期小鼠乳腺中Cyclin D1、CyclinD3和PCNA的表達(dá)量(圖6)。

圖4 U0126對月桂酸促進(jìn)mMECs中細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響 A.Western blot;B.Cyclin D1;C.Cyclin D3;D.PCNA;E.pRb/Rb

圖5 不同濃度月桂酸對青春期小鼠乳導(dǎo)管分支及終末端數(shù)量的影響 A.對照組;B.0.05%月桂酸組；C.0.10%月桂酸組；D.1.00%月桂酸組

圖6 月桂酸對青春期小鼠乳腺中細(xì)胞增殖標(biāo)志物表達(dá)的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L的月桂酸通過ERK1/2信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)而增加了Rb蛋白的磷酸化水平促進(jìn)mMECs增殖。此外，飲用水中含0.05%的月桂酸也顯著增加了青春期小鼠乳腺中乳導(dǎo)管分支及終末端的形成，并顯著增加了Cyclin D1、Cyclin D3和PCNA的表達(dá)。

乳腺的主要作用是分泌乳汁從而為新生兒提供營養(yǎng)[13]。乳腺上皮細(xì)胞是乳導(dǎo)管的重要組成部分，一般來說，乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量決定了泌乳量。因此，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖可增加泌乳量[14]。乳腺上皮細(xì)胞增殖受激素水平、營養(yǎng)條件等多種因素影響。已有研究表明，長鏈脂肪酸中油酸、n-3多不飽和脂肪酸等可促進(jìn)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳腺發(fā)育[8,15]，而硬脂酸則抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖[16]。月桂酸是一種12碳的中鏈脂肪酸，我們研究發(fā)現(xiàn)，月桂酸可顯著促進(jìn)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳導(dǎo)管的發(fā)育。

細(xì)胞增殖標(biāo)志物(Cyclin D1/D3和PCNA)在調(diào)控細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。研究表明，Cyclin D1通過結(jié)合并激活CDK4/6從而與Rb蛋白結(jié)合[17]，進(jìn)而促進(jìn)Rb-E2F1復(fù)合物解離，從而推動細(xì)胞由G1期到S期過渡[18-19]。此外，Cyclin D1的高表達(dá)也與乳腺癌的發(fā)生具有密切的關(guān)聯(lián)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1也可與PCNA結(jié)合，進(jìn)而抑制DNA合成，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[21]。PCNA是一種在DNA復(fù)制和損傷修復(fù)中起重要作用的核蛋白，其在S期的表達(dá)明顯增加[22]。作為DNA聚合酶的輔助蛋白，PCNA鏈接著DNA聚合酶在DNA鏈上滑動，為聚合酶的持續(xù)工作發(fā)揮作用[23]。Cyclin D3與Cyclin D1的作用相似，可以促進(jìn)G1/S期的轉(zhuǎn)換，還可以維持終末分化，在已分化組織的靜止細(xì)胞中普遍高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的生長與增殖中起關(guān)鍵作用[24]。已有研究發(fā)現(xiàn)，添加高表達(dá)Cyclin D3可以有效促進(jìn)細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，當(dāng)誘導(dǎo)HL-60白血病細(xì)胞分化時，Cyclin D3的表達(dá)明顯增高[25]。在本研究中，100 μmol/L的月桂酸顯著增加了mMECs中Cyclin D1/D3和PCNA蛋白的表達(dá)量。此外，在體內(nèi)試驗中我們發(fā)現(xiàn)，月桂酸不僅促進(jìn)了乳導(dǎo)管分支及終末端的形成，也增加了青春期小鼠乳腺中Cyclin D1/D3和PCNA的表達(dá)量。這表明月桂酸可能通過增加Cyclin D1/D3和PCNA的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)mMECs的增殖。

為了研究月桂酸如何通過細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)來促進(jìn)mMECs增殖，我們隨后檢測了與增殖相關(guān)的ERK1/2信號通路。此前的研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號通路的激活可以顯著促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化及遷移[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)，長鏈不飽和脂肪酸可通過ERK1/2信號通路促進(jìn)BMECs增殖[27]。本研究在添加ERK1/2抑制劑后發(fā)現(xiàn)，月桂酸通過ERK1/2信號通路增加Cyclin D1/D3和PCNA的蛋白表達(dá)。此外，月桂酸還增加了p-Rb/Rb的比值，而ERK1/2抑制劑消除了這種作用。這表明月桂酸可能通過ERK1/2信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)來促進(jìn)mMECs的增殖。

本研究結(jié)果表明，月桂酸通過ERK1/2信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)青春期小鼠乳腺的發(fā)育。