王金坡，崔亮亮，孫秀秀，王璐夢，劉曉麗，胡薛英，谷長勤，張萬坡，程國富

(華中農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，湖北 武漢 430070)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemie diarrhea virus,PEDV)感染引起的一種急性、高度傳染性、高致死性病毒性腸道傳染病[1]。該病多發(fā)生在冬季，PEDV可感染各年齡段及不同品種的豬，但其臨床癥狀根據(jù)豬日齡大小而不同[2]，成年母豬發(fā)病率20%～85%，架子豬、哺乳仔豬以及育肥豬發(fā)病率不等，對2周齡以內(nèi)哺乳仔豬的危害尤為嚴重，其發(fā)病率和病死率甚至高達90%～100%[3]。該病于20世紀70年代首次在英格蘭地區(qū)豬場被發(fā)現(xiàn)，隨后在歐洲各國散發(fā)存在[4]。直到2010年PED在我國及亞洲其他國家出現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)，2013年PED在美國大面積肆虐，引起全球養(yǎng)豬業(yè)巨大經(jīng)濟損失后，才引起相關研究人員的密切關注[5]。至今，PED在發(fā)展中國家的傳播仍未得到有效控制。在我國，PED的流行趨勢依然嚴峻[6]。目前，對該病在自然感染狀態(tài)下病理形態(tài)學的細致研究甚少，因考慮到在自然感染情況下的研究較人工感染更接近于普遍臨床變化，所以本試驗通過詳細、系統(tǒng)地觀察哺乳仔豬自然感染PEDV后的各種病理學變化，旨在為進一步探究PED的致病機理及發(fā)病規(guī)律提供可靠的理論依據(jù)，以便更有效地指導臨床。

1 材料與方法

1.1 病料來源臨床體征疑似PEDV感染的7頭3～5日齡哺乳仔豬均來自廣西貴港市某豬場，了解豬群發(fā)病癥狀和飼養(yǎng)管理等情況后，對仔豬進行病理剖檢，經(jīng)湖北省動物疫病預防控制中心檢測，確定為PEDV抗原陽性，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PRoV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬庫布病毒(PKV)等常見豬傳染病抗原均為陰性。

1.2 主要試劑及儀器dNTP、Taq DNA聚合酶：MBI Fermentas，加拿大；Easy Pure Viral DNA/RNA Kit試劑盒：北京全式金生物技術有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑：TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；HRP標記山羊抗兔/鼠IgG：基因科技(上海)股份有限公司；AEC顯色劑：北京索萊寶科技有限公司；RM2235切片機：萊卡，德國；Nikon 80i生物光學顯微鏡：Nikon，日本；SU8100型掃描電鏡和HT7700型透射電鏡：HITACHI，日本。

1.3 組織病理學觀察將所取組織經(jīng)福爾馬林固定后制成石蠟切片，HE染色，通過NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)配合Nikon 80i生物光學顯微鏡對典型病變進行顯微采圖并詳細記錄。

1.4 亞細胞結(jié)構(gòu)觀察

1.4.1場發(fā)射掃描電鏡觀察 取新鮮的空腸組織，放入戊二醛溶液中固定過夜，再經(jīng)鋨酸固定，乙醇脫水，臨界點干燥，粘樣，噴金，SU8100型掃描電鏡觀察，采集圖像分析。

1.4.2透射電鏡觀察 取新鮮的空腸組織，放入戊二醛溶液中固定過夜，再經(jīng)鋨酸固定，丙酮脫水，包埋，聚合，制成超薄切片，鈾鉛雙重染色，HT7700型透射電鏡觀察，采集圖像分析。

1.5 免疫組織化學檢測利用常規(guī)免疫組化方法對所取組織中的PEDV進行原位檢測。分別設立空白對照、陰性對照與陽性對照。鼠抗PEDV單克隆抗體(華中農(nóng)業(yè)大學肖少波教授課題組饋贈)稀釋度為1∶400，二抗為HRP標記的山羊抗鼠抗體，用AEC顯色，通過NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)配合Nikon 80i生物光學顯微鏡進行采圖分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及剖檢變化臨床癥狀：發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)身體消瘦、被毛粗亂、眼窩下陷、精神沉郁、扎堆、厭食、嘔吐、水樣腹瀉，糞便呈黃色，有腥臭味。腹瀉脫水嚴重者，無力站立，甚至出現(xiàn)死亡。

剖檢變化：小腸鼓氣，腸腔內(nèi)充滿黃色或黃綠色內(nèi)容物，腸壁變薄，呈半透明狀，缺乏彈性(圖1B)；胃內(nèi)有未消化的乳凝塊(圖1C)；腸系膜淋巴結(jié)充血腫脹(圖1D)；其他器官未見明顯的眼觀病變。

2.2 組織病理學觀察胃腸道：腸道組織內(nèi)廣泛出現(xiàn)毛細血管淤血情況。小腸有卡他性或漿液性炎癥出現(xiàn)。十二指腸腸絨毛萎縮，黏膜上皮細胞壞死、脫落，固有層裸露，伴有少量淋巴細胞浸潤，部分腸腺上皮細胞壞死(圖2A)?？漳c腸絨毛萎縮嚴重，上皮細胞邊緣不規(guī)則缺損，細胞質(zhì)空泡化嚴重，固有層可見少量細胞壞死(圖2B)?；啬c可見腸絨毛上皮細胞部分空泡化，壞死，腸淋巴結(jié)處可見細胞核碎片，腸腔內(nèi)充滿脫落的上皮細胞(圖2C)。大腸內(nèi)有出血性或漿液性炎癥出現(xiàn)。盲腸黏膜被覆一層不完整的扁平上皮，固有層水腫、疏松，伴有少量淋巴細胞浸潤(圖2D)。結(jié)腸部分黏膜上皮細胞脫落，固有層毛細血管淤血、結(jié)構(gòu)疏松，黏膜上皮與固有層分離(圖2E)。腸系膜淋巴結(jié)局部組織出現(xiàn)毛細血管充血或輕微出血，細胞腫大，皮質(zhì)和髓質(zhì)界線不清，局部出現(xiàn)淋巴細胞減少(圖2F)。直腸和胃未見明顯組織病理學變化。

脾內(nèi)紅髓和白髓界線不清，局部淋巴細胞減少，并伴有大量嗜酸粒細胞浸潤(圖2G)。肺內(nèi)局部支氣管周圍出現(xiàn)肺泡壁增厚，肺泡破裂、融合(圖2H)。心肌局灶性壞死，心肌纖維變性，有少量的淋巴細胞和嗜酸粒細胞浸潤(圖2I)。肝和腎未見明顯組織病理學變化。

圖1 腹瀉仔豬(3日齡)剖檢結(jié)果 A.腸腔內(nèi)充滿黃色或黃綠色內(nèi)容物，腸壁變?。籅.胃內(nèi)有未消化的乳凝塊；C.腸系膜淋巴結(jié)，充血腫脹;D.剖檢整體變化

2.3 亞細胞結(jié)構(gòu)觀察

2.3.1場發(fā)射掃描電鏡觀察 空腸黏膜上皮細胞破裂，微絨毛普遍雜亂無章，出現(xiàn)不同程度的短縮、稀疏(圖3A)，甚至有些腸絨毛上的微絨毛幾乎消失，裸露上皮(圖3B)。

2.3.2透射電鏡觀察 空腸胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)網(wǎng)格樣變化，形成大小不等，形態(tài)不同的空泡(圖3C)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破裂、縊斷，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段(圖3D)；線粒體腫脹變圓，嵴減少、排列紊亂，有些甚至空泡化(圖3D)；胞質(zhì)內(nèi)可見散在的冠狀病毒顆粒(圖3D)。

2.4 免疫組織化學檢測在十二指腸(圖4A)、空腸(圖4B)、回腸(圖4C)、盲腸(圖4D)、結(jié)腸(圖4E)中均檢測到陽性信號，其中空腸和回腸腸段病毒載量最高，病毒僅局限于胞質(zhì)當中，在細胞核中未檢測到，并且其主要分布在黏膜絨毛上皮細胞中，偶爾在腸腺細胞內(nèi)也見有分布，而在其他組織器官中未見到陽性信號。

3 討論

目前國內(nèi)，對豬流行性腹瀉在自然感染情況下病理形態(tài)學的研究較少，考慮到人工攻毒條件下，包括病毒的傳播及感染方式在內(nèi)的諸多因素與自然條件下的感染會有一定程度的差別，因此，本研究在排除了其他病原后，以自然條件下PEDV單獨感染的哺乳仔豬為研究對象，探究其致病機理及發(fā)病規(guī)律，以便更有助于指導臨床。

在本研究中，感染PEDV的仔豬出現(xiàn)了小腸鼓氣、腸壁變薄、胃內(nèi)有未消化的乳凝塊和腸系膜淋巴結(jié)腫脹的癥狀。據(jù)卓秀萍等[7]報道，在人工感染下的研究中發(fā)現(xiàn)，心、肝、脾和腎等器官也出現(xiàn)了不同程度的病變，而在本研究中以上器官均未見眼觀病理損傷。

圖2 腹瀉仔豬(3日齡)組織病理學變化(HE) A.十二指腸腸絨毛上皮脫落，固有層裸露，伴有少量淋巴細胞浸潤；B.空腸絨毛上皮細胞胞質(zhì)空泡化嚴重；C.回腸絨毛上皮細胞壞死、脫落，腸腔內(nèi)充滿脫落的上皮細胞；D.盲腸腸黏膜被覆一層不完整的扁平上皮，固有層水腫、疏松；E.結(jié)腸固有層毛細血管淤血，黏膜上皮與固有層分離；F.腸系膜淋巴結(jié)，皮質(zhì)和髓質(zhì)界線不清，局部出現(xiàn)淋巴細胞減少；G.脾紅髓和白髓界線不清，伴有大量嗜酸粒細胞浸潤；H.肺臟局部出現(xiàn)肺泡壁增厚；I.心肌局灶性壞死，伴有少量淋巴細胞和嗜酸粒細胞浸潤。圖中右上角圖片為箭頭處放大后的高倍鏡視野(400×)

圖3 腹瀉仔豬(3日齡)空腸亞細胞結(jié)構(gòu)變化 A.黏膜上皮微絨毛雜亂無章、短縮、稀疏；B.黏膜上皮微絨毛幾乎消失、裸露上皮；C.胞質(zhì)內(nèi)形成大小不等，形態(tài)不同的空泡；D.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)縊斷，線粒體腫脹變圓，胞質(zhì)內(nèi)可見散在的冠狀病毒顆粒(箭頭處)

圖4 腹瀉仔豬(3日齡)腸道免疫組化結(jié)果 A.十二指腸；B.空腸；C.回腸；D.盲腸；E.結(jié)腸

小腸是豬消化吸收的主要器官，腸絨毛在消化吸收中具有重要的作用，環(huán)形皺襞和微絨毛大大增加了小腸的總面積[8]。在本研究中，仔豬感染PEDV后，小腸絨毛萎縮、變短，上皮細胞崩結(jié)、脫落，上皮細胞的微絨毛脫落、稀疏，這些病變都會造成小腸總面積的減少，影響小腸的消化吸收功能，導致仔豬對營養(yǎng)物質(zhì)吸收不良、消瘦等癥狀，以上結(jié)果與JUNG 等[9]的研究一致。脾和腸系膜淋巴結(jié)均是機體的免疫器官，病毒入侵后，會刺激機體產(chǎn)生免疫反應。本研究中發(fā)現(xiàn)，脾和腸系膜淋巴結(jié)均出現(xiàn)了淋巴細胞減少的現(xiàn)象，說明PEDV感染對機體的免疫器官造成了一定程度的損傷。免疫器官的嚴重病變將使得機體更易受到其他機會致病菌以及病毒的感染，這可能也是在臨床上多見豬流行性腹瀉與其他病毒混合感染、病死率較高的原因之一[7]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，感染仔豬肺局部出現(xiàn)肺泡壁增厚和心肌局灶性壞死的現(xiàn)象，這也預示著豬流行性腹瀉可能會繼發(fā)心肺疾病，因此我們認為，在治療腹瀉的同時，也要加強對心肺疾病的預防。而在卓秀萍等[7]和閆清源[10]的研究中還發(fā)現(xiàn)肝和腎中也出現(xiàn)了較明顯的病理變化。

PEDV的致病性與其組織嗜性具有密切的關系。薄清如[11]、潘耀謙[12]的研究發(fā)現(xiàn)，豬呼吸道黏膜或豬小腸細胞刷狀緣含有大量的豬氨肽酶(pAPN)，這是PEDV感染所必需的細胞受體，它決定了病毒的組織嗜性并奠定了病毒感染、增殖的必要基礎。在本研究中發(fā)現(xiàn)，病毒分布在除直腸外的所有腸段，以小腸中病毒載量最高，但肺中未見有病毒分布。并且我們發(fā)現(xiàn)病毒僅局限于上皮細胞或腸腺細胞的胞質(zhì)當中，而細胞核中未檢測到病毒，此結(jié)果與遇秀玲等[13]和楊臣等[14]在人工感染下的研究結(jié)果一致，兩種不同方式感染的研究都說明了PEDV侵害的是腸上皮細胞和腸腺細胞并且寄居在胞質(zhì)當中。

據(jù)DUCATELLE等[15]報道，PEDV經(jīng)過口感染后進入消化道，識別小腸絨毛上皮細胞直接侵入細胞，利用宿主細胞的多種蛋白進行生物合成，完成整個病毒復制過程。本研究通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PEDV感染的腸上皮細胞中線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)縊斷，胞質(zhì)空泡化，且胞質(zhì)內(nèi)可見散在的病毒顆粒，推測病毒感染進程可能是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中完成復制，然后突破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入到胞質(zhì)當中，破壞了線粒體結(jié)構(gòu)，使細胞能量產(chǎn)出功能受損，代謝功能紊亂，繼而出現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)空泡化現(xiàn)象。而在遇秀玲等[13]和閆清源[10]的研究中還發(fā)現(xiàn)胞核和溶酶體等結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)了不同程度的病理損傷。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)，哺乳仔豬在自然感染PEDV條件下，出現(xiàn)的病理損傷主要集中在腸道系統(tǒng)，而其他器官出現(xiàn)的病理損傷較輕微，涉及器官較少，而在人工感染PEDV條件下，不但腸道系統(tǒng)出現(xiàn)了明顯的病理變化，而且其他組織器官均出現(xiàn)了不同程度的病理損傷，涉及范圍更廣。我們推測，出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因可能是兩種不同感染方式條件下，毒株類型，病毒的傳播、感染方式和感染計量存在一定的差別。因為人工感染普遍采取口服的方式，而PEDV的傳播除糞口途徑之外，近年來報道還可以通過空氣進行傳播[16]，而后者恰恰是人工感染忽略的地方，在臨床上，兩種傳染方式應該都存在，所以我們建議在人工進行PEDV感染試驗時，可以在口服病毒的同時，也考慮滴鼻的方式，這樣建立的感染模型更加接近于臨床狀態(tài)，從而對PED進行的研究更具信服力。