鄭文亞，彭瑞妮，劉 犇，張?chǎng)┰?，?婷，章志濤，李國(guó)生，鄒劍偉，崔 燕

(1.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司，江西 宜春 336000)

隨著我國(guó)山羊養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，在山羊養(yǎng)殖過(guò)程中，由于引種、異地采購(gòu)、異地繁育等需要，遠(yuǎn)距離運(yùn)輸難以避免。目前主要以車(chē)輛運(yùn)輸為主，長(zhǎng)途運(yùn)輸過(guò)程中，顛簸、震動(dòng)、噪音、高(低)溫和禁食禁水等刺激因素往往導(dǎo)致山羊發(fā)生心跳呼吸頻率加快、驚恐或狂躁不安等應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)應(yīng)激強(qiáng)度超過(guò)機(jī)體的自我調(diào)節(jié)能力時(shí)，其免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p害，體質(zhì)條件差的山羊甚至?xí)l(fā)生死亡，由運(yùn)輸應(yīng)激引起的疾病和死亡對(duì)山羊養(yǎng)殖帶來(lái)的危害及經(jīng)濟(jì)損失不容小覷。熱休克蛋白(HSPs)是細(xì)胞在應(yīng)激原誘導(dǎo)下生成的一組蛋白質(zhì)，與運(yùn)輸應(yīng)激關(guān)系緊密，其中HSP27、HSP70和HSP90是研究較多的應(yīng)激誘導(dǎo)型熱休克蛋白[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于應(yīng)激對(duì)動(dòng)物熱休克蛋白影響的報(bào)道，主要以鼠[3]、雞[4]和豬[5]等為研究對(duì)象，對(duì)山羊等反芻動(dòng)物的研究較少。有研究表明，熱休克蛋白可以與一些抗原遞呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等上的某些Toll樣受體(TLR)結(jié)合來(lái)激活非特異性免疫系統(tǒng)，此外，特異性免疫系統(tǒng)也可以借助這種方式被激活[6]。因此，熱休克蛋白能通過(guò)上述途徑來(lái)介導(dǎo)免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)與免疫器官的結(jié)構(gòu)和功能密不可分，本試驗(yàn)就運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)山羊免疫器官的病理?yè)p傷以及熱休克蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行研究，為減少山羊運(yùn)輸損傷和探明抗運(yùn)輸應(yīng)激機(jī)制等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)將12只飼養(yǎng)條件相同，體質(zhì)量相近(13.89±2.96) kg的健康公山羊隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、運(yùn)輸應(yīng)激2 h組和6 h組。對(duì)照組在原來(lái)環(huán)境下正常飼養(yǎng)，其余2組分別進(jìn)行2 h和6 h的運(yùn)輸(車(chē)速35～45 km/h)，車(chē)內(nèi)溫度28～32℃，途中禁食禁水，運(yùn)輸后立即剖殺，采集腸系膜淋巴結(jié)和脾臟，分別放入4%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定液和液氮中，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)材料小鼠SP試劑盒和DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉生物工程公司；HSP27、HSP70、HSP90等一抗和二抗Goat Anti-Mouse IgG購(gòu)自Abcam公司；Mouse Anti-β-actin、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自博士德生物；總蛋白提取試劑盒和蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)購(gòu)自普利萊基因技術(shù)公司；4×Protein SDS PAGE Loading Buffer購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)公司；超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自US Everbright Inc公司。

1.3 顯微和超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察將4%多聚甲醛固定的淋巴結(jié)和脾臟組織在流水中沖洗過(guò)夜，取出后經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋等步驟，制成5 μm厚的連續(xù)切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并拍照；將2.5% 戊二醛固定的淋巴結(jié)和脾臟組織，經(jīng)1%鋨酸固定，脫水、包埋和超薄切片機(jī)切片后，用醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀(guān)察并拍照。

1.4 免疫組織化學(xué)染色切片脫蠟至水，在檸檬酸緩沖液中進(jìn)行微波抗原修復(fù)，按照小鼠SP試劑盒說(shuō)明操作。一抗均按照1∶400稀釋后使用，DAB顯色后用蘇木精復(fù)染。經(jīng)脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀(guān)察，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕色為強(qiáng)表達(dá)，黃色為中等表達(dá)，淡黃色為弱表達(dá)，不著色為不表達(dá)。

1.5 Western blot測(cè)淋巴結(jié)和脾臟樣品質(zhì)量后用總蛋白提取試劑盒制備蛋白樣品，用BCA法測(cè)定蛋白濃度并將正常組和運(yùn)輸組的蛋白濃度調(diào)為一致，按1∶3的比例加入4×Protein SDS PAGE Loading Buffer，95℃變性10min后上樣。電泳2.5 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用PVDF膜濕轉(zhuǎn)1 h，電轉(zhuǎn)后取出PVDF膜用TBST漂洗后封閉2 h，再用TBST漂洗3次，10 min/次，放入一抗(HSP27 1∶5 000，HSP70 1∶1 000，HSP90 1∶1 000，內(nèi)參蛋白Mouse Anti-β-actin 1∶1 000)在垂直混合儀中4℃孵育18 h；取出后用TBST漂洗3次，10 min/次，接下來(lái)放入二抗(一抗為HSP27、HSP70、HSP90和內(nèi)參蛋白對(duì)應(yīng)的二抗?jié)舛确謩e為1∶8 000，1∶20 000，1∶2 000，1∶10 000)在水平搖床上孵育2 h后用TBST漂洗3次，10 min/次，最后用超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒在暗環(huán)境下顯色并在Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀上拍照。

1.6 圖像采集與統(tǒng)計(jì)分析將圖片用Image Pro Plus 6.0軟件讀取目的條帶密度值后，與內(nèi)參蛋白密度值進(jìn)行比較，記為測(cè)試值。再用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果記為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 淋巴結(jié)和脾臟的病理學(xué)觀(guān)察

2.1.1淋巴結(jié) 光鏡觀(guān)察顯示，與對(duì)照組相比，運(yùn)輸2 h組皮質(zhì)的淋巴小結(jié)體積增大，數(shù)量增多，生發(fā)中心明顯；髓質(zhì)的髓索變粗，髓竇中充滿(mǎn)淡紅色紅染物質(zhì)，且伴有巨噬細(xì)胞增生。運(yùn)輸6 h時(shí)，淋巴小結(jié)增生愈發(fā)明顯，但生發(fā)中心的淋巴細(xì)胞核可見(jiàn)核碎片，淋巴細(xì)胞數(shù)量有所下降，髓質(zhì)中髓索和髓竇的界限不清(圖1)。電鏡觀(guān)察顯示，運(yùn)輸6 h組淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞線(xiàn)粒體腫脹，出現(xiàn)空洞；部分淋巴細(xì)胞核膜破裂，染色質(zhì)呈碎塊狀，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清；少數(shù)淋巴細(xì)胞胞核呈鋸齒狀或核膜凹陷；偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞核中出現(xiàn)包涵體，網(wǎng)狀細(xì)胞線(xiàn)粒體腫脹變空，形態(tài)異常，呈細(xì)長(zhǎng)型；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒(圖2)。

圖1 山羊淋巴結(jié)的顯微結(jié)構(gòu)觀(guān)察 A～C.對(duì)照組;D～F.運(yùn)輸應(yīng)激2 h組;G～I(xiàn).運(yùn)輸應(yīng)激6 h組。C.被膜;LN.淋巴小結(jié);MC.髓索;MS.髓竇;圓框.淡紅色滲出物;箭頭(黑).巨噬細(xì)胞

圖2 山羊淋巴結(jié)的超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察 A～F.運(yùn)輸應(yīng)激6 h組淋巴結(jié)超微結(jié)構(gòu)電鏡觀(guān)察不同視野圖。L.淋巴細(xì)胞;ret.網(wǎng)狀細(xì)胞;M.線(xiàn)粒體;RER.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);箭頭(黑).核膜凹陷;圓框.包涵體

2.1.2脾臟 光鏡觀(guān)察顯示，與對(duì)照組相比，運(yùn)輸2 h 組脾小結(jié)增生，邊緣區(qū)面積明顯增寬，紅髓中可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，且有含鐵血黃素顆粒散在分布。運(yùn)輸6 h時(shí)，紅髓中的紅細(xì)胞數(shù)量有所減少，脾小結(jié)淋巴細(xì)胞可見(jiàn)核碎片，且數(shù)量有所減少，細(xì)胞間空隙變寬(圖3)。電鏡觀(guān)察顯示，脾臟的淋巴細(xì)胞線(xiàn)粒體腫脹變空，嵴斷裂或減少；部分淋巴細(xì)胞高爾基體擴(kuò)張，扁平囊膜出現(xiàn)空泡，偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)包涵體。淋巴細(xì)胞間可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，固縮，電子密度高，核質(zhì)比增大，核周間隙增寬，可見(jiàn)凋亡小體。髓質(zhì)中出現(xiàn)較多中性粒細(xì)胞，其表面短小微絨毛消失，表面光滑，染色質(zhì)固縮，核膜破裂，小梁內(nèi)平滑肌細(xì)胞線(xiàn)粒體腫脹變空，呈細(xì)長(zhǎng)形。網(wǎng)狀細(xì)胞線(xiàn)粒體腫脹，內(nèi)腔基質(zhì)中出現(xiàn)界限不清的絮狀物質(zhì)。漿細(xì)胞核周間隙變寬，內(nèi)部清亮，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，局部擴(kuò)張，似篩狀結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖3 山羊脾臟的顯微結(jié)構(gòu)觀(guān)察 A～B.對(duì)照組;C～D.運(yùn)輸2 h組;E～F.運(yùn)輸6 h組。RP.紅髓;SN.脾小結(jié);黑箭頭.含鐵血黃素顆粒

圖4 山羊脾臟的超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察 A～F.運(yùn)輸應(yīng)激6 h組脾臟超微結(jié)構(gòu)電鏡觀(guān)察不同視野圖。L.淋巴細(xì)胞；RBC.紅細(xì)胞；NG.中性粒細(xì)胞；SMC.平滑肌細(xì)胞；ret.網(wǎng)狀細(xì)胞；P.漿細(xì)胞；M.線(xiàn)粒體；RER.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；圓形框.核內(nèi)包涵體；黑箭頭.核周隙增寬；白箭頭.核膜破裂；正方形框.小梭形的特殊顆粒；長(zhǎng)方形框.圓形的嗜天青顆粒；橢圓框.密體；三角形框.絮狀物質(zhì)

2.2 熱休克蛋白在淋巴結(jié)和脾臟的表達(dá)

2.2.1淋巴結(jié) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HSP27在對(duì)照組和運(yùn)輸應(yīng)激組的表達(dá)部位沒(méi)有明顯差異，在被膜和小梁以及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈黃色，網(wǎng)狀細(xì)胞和髓竇竇壁內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈黃色，淋巴小結(jié)有散在的淋巴細(xì)胞胞核呈棕色，淋巴小結(jié)周?chē)鷱浬⒘馨徒M織有部分淋巴細(xì)胞胞核呈棕色。HSP70在被膜和小梁以及血管內(nèi)皮細(xì)胞不著色，網(wǎng)狀細(xì)胞和髓竇竇壁內(nèi)皮細(xì)胞呈淡黃色。對(duì)照組和運(yùn)輸應(yīng)激2 h組在淋巴小結(jié)和髓索的淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈黃色，運(yùn)輸6 h后淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈淡黃色。HSP90在對(duì)照組淋巴小結(jié)和髓索中的淋巴細(xì)胞胞核和胞質(zhì)呈淡黃色，運(yùn)輸處理2h后，淋巴細(xì)胞胞核和胞質(zhì)呈黃色，運(yùn)輸持續(xù)6 h時(shí)呈棕色(圖5)。

2.2.2脾臟 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HSP27在脾臟的被膜、小梁以及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈黃色，對(duì)照組脾小結(jié)和邊緣區(qū)有散在淋巴細(xì)胞胞核呈棕色，外套區(qū)淋巴細(xì)胞胞核呈棕色，紅髓部分淋巴細(xì)胞胞核呈黃色，運(yùn)輸2 h組紅髓淋巴細(xì)胞表達(dá)明顯，大部分淋巴細(xì)胞胞核呈棕色，運(yùn)輸6 h組HSP27的表達(dá)情況與對(duì)照組類(lèi)似。HSP70在脾臟的被膜、小梁以及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)不著色，對(duì)照組在脾小結(jié)的淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈黃色，外套區(qū)幾乎不著色，邊緣區(qū)有散在的淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈棕色，運(yùn)輸處理2 h，脾小結(jié)陽(yáng)性表達(dá)淋巴細(xì)胞減少，只有散在的淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈淡黃色，運(yùn)輸6 h組與2 h組的HSP70表達(dá)情況相似。HSP90在脾臟的被膜、小梁及血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)，對(duì)照組脾小結(jié)和邊緣區(qū)淋巴細(xì)胞胞質(zhì)呈淡黃色，有少數(shù)在胞核呈淡黃色，外套區(qū)幾乎不著色，運(yùn)輸2 h組和6 h組脾小結(jié)外套區(qū)淋巴細(xì)胞出現(xiàn)表達(dá)，胞核呈黃色，且與對(duì)照組相比，脾小結(jié)陽(yáng)性表達(dá)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多(圖6)。

2.3 熱休克蛋白在淋巴結(jié)和脾臟的定量表達(dá)

2.3.1淋巴結(jié) Western blot結(jié)果顯示，山羊淋巴結(jié)HSP27蛋白表達(dá)量在對(duì)照組、運(yùn)輸2 h和6 h組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。運(yùn)輸2 h組HSP70蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)，而運(yùn)輸6 h 組HSP70蛋白表達(dá)量與2 h組相比下降，與對(duì)照組和2 h組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。運(yùn)輸2 h和6 h組HSP90蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而2 h和6 h組間HSP90蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。

圖5 HSP27、HSP70和HSP90在山羊淋巴結(jié)內(nèi)表達(dá) A～C.HSP27表達(dá)情況；D～F.HSP70表達(dá)情況；G～I(xiàn).HSP90表達(dá)情況。A，D，G.對(duì)照組；B，E，H.運(yùn)輸2 h組；C，F(xiàn)，I.運(yùn)輸6 h組。LN.淋巴小結(jié)；NC.小結(jié)帽

圖6 HSP27、HSP70和HSP90在山羊脾臟內(nèi)的表達(dá) A～C.HSP27表達(dá)情況；D～F.HSP70表達(dá)情況；G～I(xiàn).HSP90表達(dá)情況。A，D，G.對(duì)照組；B，E，H.運(yùn)輸2 h組；C，F(xiàn)，I.運(yùn)輸6 h組。SN.脾小結(jié)；黑箭頭.外套區(qū)

圖7 運(yùn)輸應(yīng)激2 h組、6 h組與對(duì)照組山羊淋巴結(jié)HSP27、HSP70和HSP90的相對(duì)表達(dá)量 同一蛋白3個(gè)組間不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.3.2脾臟 Western blot結(jié)果顯示，運(yùn)輸2 h組山羊脾臟HSP27蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)，運(yùn)輸6 h組HSP27蛋白表達(dá)量比運(yùn)輸2 h組下降，但與對(duì)照組和運(yùn)輸2 h組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，運(yùn)輸2 h組HSP70蛋白表達(dá)量下降，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，但運(yùn)輸6 h組HSP70蛋白表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，與2 h組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。運(yùn)輸2 h 和6 h組HSP90蛋白表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而2 h和6 h組之間HSP90蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。

3 討論

運(yùn)輸是動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，運(yùn)輸質(zhì)量的好壞不僅關(guān)乎動(dòng)物經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還是有關(guān)動(dòng)物福利的一個(gè)重要因素。有研究表明，盡量減少運(yùn)輸時(shí)間，可以減少動(dòng)物應(yīng)激損傷從而保障動(dòng)物福利[7]。運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)動(dòng)物而言雖初期裝載和運(yùn)輸環(huán)境的心理壓力有所緩解，但疲勞、代謝損害和脫水等對(duì)它們的健康造成進(jìn)一步的負(fù)面影響[8]。DE LA FUENTE等[9]對(duì)羔羊研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸30 min的羔羊血液中皮質(zhì)醇和乳酸脫氫酶的濃度明顯高于運(yùn)輸5 h，提示運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體損傷在運(yùn)輸前期比較明顯，隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷可能得到緩解。同時(shí)也暗示不同運(yùn)輸時(shí)間對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成的應(yīng)激性損傷有所不同。

圖8 運(yùn)輸應(yīng)激2 h組、6 h組與對(duì)照組山羊脾臟HSP27、HSP70和HSP90的相對(duì)表達(dá)量 同一蛋白3個(gè)組間不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸2 h時(shí)，山羊的淋巴結(jié)和脾臟中的淋巴小結(jié)及脾小結(jié)增生明顯，運(yùn)輸時(shí)間持續(xù)到6 h時(shí)，淋巴小結(jié)和脾小結(jié)的淋巴細(xì)胞都有核碎片，淋巴細(xì)胞線(xiàn)粒體腫脹呈空泡化，核膜凹陷，核內(nèi)出現(xiàn)包涵體，網(wǎng)狀細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，脾臟中的中性粒細(xì)胞微絨毛消失，核膜出現(xiàn)破裂。以上淋巴結(jié)和脾臟的病理變化，與山羊的免疫功能密切相關(guān)。淋巴結(jié)和脾臟是機(jī)體重要的外周免疫器官，是淋巴細(xì)胞聚集和生成的場(chǎng)所，2 h的運(yùn)輸刺激尚未超過(guò)機(jī)體的自我調(diào)節(jié)能力，能使山羊免疫器官動(dòng)員起來(lái)，代償性增生免疫細(xì)胞，提高免疫機(jī)能，以應(yīng)對(duì)不良應(yīng)激。張彩霞等[10]通過(guò)稀釋運(yùn)輸2 h后的豬血清，發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)正常豬的外周淋巴細(xì)胞的增殖，也驗(yàn)證了這一觀(guān)點(diǎn)。然而機(jī)體的代償是有一定限度的，超過(guò)其承受能力，極易誘導(dǎo)不完全代償甚至是失代償?shù)那闆r發(fā)生。在對(duì)山羊長(zhǎng)途運(yùn)輸12 h后，發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞減少，導(dǎo)致機(jī)體免疫受到抑制[11]；小鼠處于冷應(yīng)激時(shí)，前期機(jī)體處于積極抵抗?fàn)顟B(tài)，后期機(jī)體的抵抗力是消極的[12]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，淋巴細(xì)胞的增殖在運(yùn)輸條件下具有時(shí)效性[13]，隨著運(yùn)輸時(shí)間的增加，代償能力受損，機(jī)體開(kāi)始出現(xiàn)免疫抑制。

熱休克蛋白(HSPs)是Ritossa在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，自此引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。其作為一種天然的生理工具，無(wú)論是它們?cè)谛律鞍字械陌閭H功能還是細(xì)胞應(yīng)激后的治療作用都引起了研究者們極大的興趣[14]。按照相對(duì)分子質(zhì)量的大小，熱休克蛋白可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱休克蛋白sHSP五個(gè)家族。其中報(bào)道較多的是HSP90、誘導(dǎo)型HSP70(也稱(chēng)為HSP72)和小熱休克蛋白HSP27[15]。這3種蛋白與關(guān)鍵的凋亡因子有關(guān)，是功能強(qiáng)大的抗凋亡蛋白，能不同程度地阻斷細(xì)胞死亡[16]，是增強(qiáng)各種信號(hào)蛋白如CDK4、細(xì)胞周期激酶、類(lèi)固醇激素受體和免疫防御反應(yīng)的主要因素。HSP90占細(xì)胞總量的1%～2%，經(jīng)誘導(dǎo)后從基線(xiàn)水平增加到4%～6%[16-17]；HSP70作為分子伴侶蛋白，通過(guò)分子間的相互作用保護(hù)已合成的蛋白質(zhì)免受進(jìn)一步的損傷，且能夠區(qū)分是應(yīng)該修復(fù)細(xì)胞損傷并抑制細(xì)胞凋亡，還是在細(xì)胞損傷無(wú)法治療時(shí)允許凋亡發(fā)生[18-19]；HSP27具有較強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用，主要是由于它能在不同階段阻斷細(xì)胞凋亡[2]。這3種蛋白在機(jī)體受到外來(lái)應(yīng)激時(shí)各司其職，協(xié)同作用，以促進(jìn)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。運(yùn)輸應(yīng)激時(shí)，山羊免疫組織細(xì)胞中的熱休克蛋白含量也會(huì)發(fā)生變化，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，協(xié)助組織細(xì)胞耐過(guò)逆境。有研究表明，免疫器官能感知熱休克蛋白表達(dá)水平的改變，比如香芹酚等就可能通過(guò)促進(jìn)熱休克蛋白的生成來(lái)支持免疫調(diào)節(jié)[20]。FAN等[21]證實(shí)，腸外補(bǔ)充谷氨酰胺(GLN)聯(lián)合腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，可上調(diào)HSP90的表達(dá)，減輕淋巴器官和循環(huán)淋巴細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)免疫力，提高燒傷大鼠的成活率。對(duì)患膿毒癥動(dòng)物添加脫氫表雄酮時(shí)，可以上調(diào)肺部和脾臟HSP70的表達(dá)量，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫；對(duì)雞的硒缺乏癥研究發(fā)現(xiàn)，在雞的脾臟和胸腺中HSP70和HSP90明顯上升，進(jìn)而改善免疫狀態(tài)[22-23]。此外，HSP27、HSP70和HSP90在雞的免疫器官中顯著升高，并在氧化應(yīng)激條件下表現(xiàn)出保護(hù)作用[24]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)山羊運(yùn)輸應(yīng)激處理后，HSP90在淋巴結(jié)和脾臟中表達(dá)量顯著升高，而HSP70和HSP27在運(yùn)輸6 h后，相比運(yùn)輸2 h分別在淋巴結(jié)和脾臟中出現(xiàn)表達(dá)下降的趨勢(shì)，并且免疫組織也開(kāi)始出現(xiàn)一些不可逆性的損傷。這可能與淋巴小結(jié)、脾小結(jié)中HSP70和彌散淋巴組織中HSP27的表達(dá)下調(diào)有一定的相關(guān)性，而HSP90的上調(diào)可能是為了緩解免疫組織的壓力。HSP70在脾臟中的下調(diào)可能由于應(yīng)激時(shí)其儲(chǔ)備量被用來(lái)緩解壓力，消耗與合成還未形成正比。運(yùn)輸應(yīng)激2 h時(shí)，脾小結(jié)大量增生與HSP70的保護(hù)作用是分不開(kāi)的。運(yùn)輸應(yīng)激6 h時(shí)，脾臟中淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，雖然HSP90上調(diào)發(fā)揮保護(hù)作用，但隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)，應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損害進(jìn)一步累加，HSP70的消耗量也大大增加，在這種失衡條件下，機(jī)體形成不可逆的病理?yè)p傷?？傊?，運(yùn)輸應(yīng)激可導(dǎo)致山羊免疫器官的組織損傷以及3種熱休克蛋白表達(dá)水平的變化。