姚 倩，王俊偉，王莎莎，李蘊(yùn)慧，趙姍姍，宋軍科，趙光輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種呈世界性分布的人畜共患寄生性原蟲[1]，可感染人和多種動(dòng)物，嚴(yán)重危害其健康和生命。隱孢子蟲主要寄生于人和動(dòng)物的胃腸道上皮細(xì)胞，造成宿主嚴(yán)重腹瀉，幼畜和免疫缺陷型的動(dòng)物尤為易感，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致其死亡[2]。人和動(dòng)物常通過污染的娛樂用水、飲用水、食物或相互接觸而遭受感染[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，豬具有較高的隱孢子蟲感染率，由隱孢子蟲寄生于豬的腸道而引起的豬隱孢子蟲病可導(dǎo)致豬發(fā)生以腹瀉、精神沉郁、厭食、消瘦等為主要臨床癥狀的消化道疾病，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。1992年，蔣金書等[4]首次對(duì)國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)隱孢子蟲感染情況進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲廣泛存在于豬場(chǎng)中，且低日齡的仔豬更易感。隨后各省市陸續(xù)出現(xiàn)豬隱孢子蟲病的相關(guān)報(bào)道，如云南[5]、安徽[6]、上海[7]、河南[8]、重慶[9]等地豬場(chǎng)隱孢子蟲的平均感染率分別為13.18%(17/129),4.8%(24/500),20.66%(312/1510),8.89%(127/1429)和16.93%(303/1790)；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)豬可以感染多種隱孢子蟲，其中以種母豬隱孢子蟲(C.scrofarum)和豬隱孢子蟲(C.suis)最常見[10]。為了摸清陜西省仔豬隱孢子蟲病的流行情況，本研究采用基于18S rRNA基因位點(diǎn)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)陜西省5個(gè)地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)仔豬的隱孢子蟲感染率和種類分布進(jìn)行了研究，以期為該地區(qū)豬場(chǎng)隱孢子蟲病科學(xué)防控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品的采集在陜西省周至、岐山、勉縣、臨潼、榆陽(yáng)5個(gè)地區(qū)的5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)收集仔豬新鮮糞便樣品共375份，包括155份斷奶前仔豬(<25 d)和220份斷奶后仔豬(1～4 月齡)糞便樣品。每份分別單獨(dú)放入干燥潔凈的塑料袋中，詳細(xì)標(biāo)記好采樣時(shí)間、地點(diǎn)、年齡等信息，隨后將裝有糞便樣品的塑料袋放入低溫保存箱內(nèi)，迅速運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)移至2.5%的重鉻酸鉀溶液中，4℃冰箱保存。

1.2 糞便樣品隱孢子蟲的檢測(cè)及顯微觀察取約10 g糞便，加水30 mL攪勻，用80目銅篩過濾。將濾液以3 500 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀加20 mL水?dāng)噭颍偌尤?0 mL乙醚去脂，混勻后3 500 r/min離心10 min，棄上清液，取5 mL糞懸液，加入30 mL飽和蔗糖溶液，混勻后3 500 r/min離心7 min，取其表液膜至載玻片在顯微鏡下觀察。

1.3 糞便基因組DNA提取每份糞便樣品取50～150 mg，放入1.5 mL的離心管中，加入適當(dāng)?shù)恼麴s水反復(fù)離心洗滌，直至上清澄澈透明，然后使用糞便基因組DNA提取試劑盒(OMEGA，USA)，按照說(shuō)明書進(jìn)行糞便基因組DNA的提取，提取的DNA樣品置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 巢式PCR基于XIAO等[11]報(bào)道的引物，利用巢式PCR對(duì)每份糞便基因組DNA樣品進(jìn)行隱孢子蟲感染情況的檢測(cè)。巢氏PCR兩輪擴(kuò)增體系均為25 μL。第一輪包括DNA模板1 μL、rTaq酶(5 U/μL)0.125 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dd H2O 15.375 μL、MgCl2(25 mol/L)2.0 μL、dNTP(2.5 mol/L)2.0 μL、第一輪上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL；第二輪反應(yīng)體系除引物為第二輪上下游引物和模板為第一輪PCR產(chǎn)物外，其余的試劑種類與劑量與第一輪相同。每輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)均設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。巢氏PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變5 min；94℃變性45 s、55℃退火45 s、72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。第二輪反應(yīng)較第一輪反應(yīng)僅退火溫度不同，第二輪反應(yīng)退火溫度為58℃。

1.5 電泳與序列測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，使用紫外分析儀檢測(cè)并用凝膠成像系統(tǒng)拍攝。將第二輪結(jié)果為陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序儀為ABI PRISM 3730 XL DNA Analyzer(Applied Biosystems，USA)。

1.6 序列分析利用Clustal X 1.83軟件將測(cè)得的序列進(jìn)行比對(duì)并參照?qǐng)D譜進(jìn)行校正，利用BLAST將校正后的序列與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行同源比對(duì)分析。為了確定隱孢子蟲種類，使用MEGA 6.1的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，以Kimura 2-parameter為模型，自展值(Bootstrap)設(shè)為1 000，以Plasmodiumcathemerium(GenBank accession number AY625-607)為外群。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS 19.0軟件中的卡方檢驗(yàn)對(duì)不同年齡和地區(qū)仔豬的隱孢子蟲感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡檢結(jié)果糞便樣品經(jīng)飽和蔗糖溶液漂浮后直接在顯微鏡下觀察，鏡檢結(jié)果如圖1所示，視野中發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲卵囊，4～6 μm，呈圓形、扁圓形和橢圓形，最外層為薄的卵囊壁，內(nèi)部有呈玫瑰紅色的子孢子(圖1)。

圖1 豬糞便樣品中的隱孢子蟲卵囊 (400×)

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果及序列分析基于18S rRNA基因位點(diǎn)的巢式PCR對(duì)采集到的375份仔豬糞便樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，101份糞便樣品擴(kuò)增出約850 bp的片段(圖2)，與預(yù)期目的片段大小一致。

圖2 仔豬隱孢子蟲18S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker；1.陽(yáng)性對(duì)照；2～5.糞便樣品；6.空白對(duì)照

2.3 仔豬隱孢子蟲感染情況將擴(kuò)增出目的片段的101份陽(yáng)性糞便樣品按照不同的年齡進(jìn)行分類(表1)，發(fā)現(xiàn)仔豬隱孢子蟲平均感染率為26.9%(101/375)，其中斷奶前仔豬(<25 d)感染率為13.5%(21/155)，而斷奶后仔豬(1～4 月齡)感染率為36.4%(80/220)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)斷奶前后仔豬隱孢子蟲感染率差異極顯著(P<0.001，χ2=24.053)。

表1 陜西省部分地區(qū)仔豬隱孢子蟲的感染情況及年齡分布

本研究所調(diào)查的5個(gè)地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)的仔豬均存在隱孢子蟲感染(表2)，周至、岐山、勉縣、臨潼、榆陽(yáng)的感染率分別為57.1%(56/98)，4.3%(3/70)，2.9%(2/70)，24.2%(15/62)，33.3%(25/75)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)地區(qū)豬場(chǎng)仔豬隱孢子蟲感染率差異極顯著(P<0.001，χ2=86.108)。

表2 陜西省部分地區(qū)仔豬隱孢子蟲地區(qū)分布

2.4 仔豬隱孢子蟲的種類鑒定通過對(duì)101份隱孢子蟲陽(yáng)性樣品進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，有90個(gè)基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的C.scrofarum位于同一進(jìn)化分支，4個(gè)基因序列與C.suis位于同一進(jìn)化分支，7個(gè)基因序列與C.parvum位于同一進(jìn)化分支，提示本研究中仔豬存在3種隱孢子蟲感染，分別為C.scrofarum、C.suis和C.parvum。

圖3 基于18S rRNA基因位點(diǎn)的仔豬隱孢子蟲的遺傳進(jìn)化樹

本研究檢測(cè)到的隱孢子蟲種在不同年齡段仔豬中的感染情況如表3所示，其中C.suis僅存在于斷奶后仔豬(1～4月齡)，C.parvum只存在于斷奶前仔豬(<25 d)，而C.scrofarum同時(shí)存在于斷奶前后仔豬，且在斷奶后仔豬的感染率高。

表3 隱孢子蟲在不同年齡仔豬中的感染情況

本研究所檢測(cè)到的隱孢子蟲種在不同地區(qū)的感染情況如表4所示，C.suis只存在于周至的豬場(chǎng)，C.parvum只存在于榆陽(yáng)的豬場(chǎng)，而C.scrofarum在5個(gè)縣區(qū)的規(guī)模化豬場(chǎng)廣泛存在。

表4 隱孢子蟲在不同地區(qū)仔豬的感染情況

3 討論

隱孢子蟲檢測(cè)通常依靠形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，然而不同種隱孢子蟲在形態(tài)學(xué)上非常相似，很難通過鏡檢進(jìn)行種類鑒定[12]。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR、巢氏PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)均已應(yīng)用于人和動(dòng)物隱孢子蟲感染的檢測(cè)[13]，相較于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)更準(zhǔn)確、高效和可靠。本研究采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法對(duì)陜西省5個(gè)地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)仔豬的隱孢子蟲感染情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)所調(diào)查地區(qū)仔豬隱孢子蟲感染率為26.9%(101/375)，低于黑龍江省0～8周齡仔豬隱孢子蟲的感染率(67.8%，40/59)[14]，也低于日本某豬場(chǎng)0～2月齡仔豬隱孢子蟲的感染率(38.3%，46/120)[15]，但略高于越南斷奶前后仔豬隱孢子蟲感染率(20.8%，118/567)[16]。本研究對(duì)陜西省5個(gè)地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，周至豬場(chǎng)隱孢子蟲感染率最高，其次為榆陽(yáng)和臨潼，而岐山和勉縣豬場(chǎng)隱孢子蟲感染率較低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)地區(qū)豬場(chǎng)感染率差異極顯著。這些差異可能與豬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理方式、驅(qū)蟲藥物使用、采樣數(shù)量以及當(dāng)?shù)氐耐寥馈⑺牡纫蛩赜嘘P(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，斷奶后仔豬隱孢子蟲感染率大于斷奶前仔豬感染率。前人某些關(guān)于隱孢子蟲感染率與年齡因素相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)[6,17-18]，斷奶后1～6月齡的仔豬比其他年齡的仔豬更容易感染隱孢子蟲，而小于1月齡的仔豬和成年豬的體內(nèi)很少檢出隱孢子蟲[14]，GUSELLE等[19]的研究發(fā)現(xiàn)仔豬在45.2日齡時(shí)容易檢出隱孢子蟲卵囊。有研究認(rèn)為斷奶仔豬更容易感染隱孢子蟲的原因可能是斷奶仔豬失去母源免疫力而自身免疫不足[17]，也可能與斷奶應(yīng)激有關(guān)[20]。然而，NGUYEN等[16]在越南的研究得出了相反的結(jié)論，他們的研究發(fā)現(xiàn)斷奶前仔豬隱孢子蟲感染率(24.7%，67/271)高于斷奶后仔豬隱孢子蟲感染率(17.2%，51/296)。基于此，斷奶因素對(duì)隱孢子蟲感染的影響需要更進(jìn)一步的研究。

本研究對(duì)仔豬感染的隱孢子蟲的種類進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，這些仔豬存在3種隱孢子蟲，分別為C.scrofarum、C.suis和C.parvum，其中C.scrofarum感染率高達(dá)89.1%(90/101)，并廣泛存在于5個(gè)地區(qū)的斷奶前后仔豬，為該地區(qū)仔豬隱孢子蟲的優(yōu)勢(shì)蟲種，這與李文超等[8]對(duì)安徽省江北地區(qū)隱孢子蟲種調(diào)查和ZOU等[21]對(duì)浙江、廣東、云南三省隱孢子蟲蟲種調(diào)查結(jié)果相同。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，C.suis僅存在于在周至斷奶后仔豬，而C.parvum只存在于榆陽(yáng)斷奶前仔豬，呈現(xiàn)一定的地區(qū)和年齡分布特征。同時(shí)，所發(fā)現(xiàn)的3種隱孢子蟲種類均為人獸共患種類，因此未來(lái)需要采集這些豬場(chǎng)人員的糞便樣品以評(píng)估其人獸共患風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，陜西省部分地區(qū)仔豬隱孢子蟲感染較為普遍，且檢測(cè)到了人獸共患C.scrofarum、C.suis和C.parvum，并以C.scrofarum為優(yōu)勢(shì)蟲種，研究結(jié)果對(duì)陜西省乃至其他地區(qū)仔豬隱孢子蟲病的防控提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。