劉 菲 劉 展

（1.湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院（湖南省人民醫(yī)院） 消化內(nèi)科，湖南 長沙 410000；2.岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南 岳陽 414000）

結(jié)腸癌是常見的消化道腫瘤之一，也是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。流行病學(xué)研究顯示，因結(jié)腸癌和/或結(jié)腸癌相關(guān)并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡約占所有腫瘤致死人數(shù)的10%左右[1]。預(yù)計到2035年，全球?qū)⑿略?50 萬結(jié)腸癌患者[2]。在50 歲以下人群中，結(jié)腸癌發(fā)生率逐年增加，以直腸癌和左側(cè)結(jié)腸癌常見。盡管遺傳、生活方式改變、肥胖和環(huán)境因素可能與結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)，但導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生率顯著增長的原因仍不明確。

研究顯示，抑癌或促癌基因發(fā)生突變后不斷積累會導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生和惡性進展。TP53/Trp53（人/小鼠p53 基因）編碼的抑癌基因p53在多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。p53除了具有抑癌作用之外，當(dāng)p53 在DNA 綁定結(jié)構(gòu)域發(fā)生錯義突變時，p53 會突變成促癌基因。但值得注意的是，p53 突變成促癌基因有以下兩種方式，一種是錯義突變的過程中發(fā)生原有野生型p53 功能的缺失，另外一種錯義突變的發(fā)生增加了具有促癌功能的基因。近年來的臨床和基礎(chǔ)研究顯示，p53 的錯義突變在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的作用十分復(fù)雜，本文就近幾年來p53 突變（包括獲得致癌性突變和丟失野生型功能突變）在結(jié)腸癌中作用的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果進行綜述。

1 結(jié)腸癌的可能發(fā)生機制

1.1 結(jié)腸癌與突變基因

大部分的結(jié)腸癌都從息肉發(fā)展而來。通常從腸腺窩異常增生開始，逐漸發(fā)展成贅生性的增生（息肉），到最終發(fā)展為結(jié)腸癌并轉(zhuǎn)移、浸潤其他器官，這一過程大致需要10-15 年。而這一過程被稱為多步驟的腫瘤發(fā)生，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中每一個步驟都與特定的抑癌基因或促癌基因的突變有關(guān)[3]。近年來全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide associated studies,GWAS）鑒 定出一些與結(jié)腸癌密切相關(guān)的突變基因，其中包括APC、KRAS、SMAD4 以 及TP53，這些突變基因與80%左右的結(jié)腸癌相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，包括APC、KRAS、SMAD4 以及TP53 在內(nèi)的基因突變與獲得干細胞特性、細胞增殖能力增強、分化能力抑制以及DNA 完整性維持能力受損密切相關(guān)，而這些改變是腫瘤細胞的特有標(biāo)志，并且是腫瘤細胞信號通路中關(guān)鍵調(diào)控基因[5]。另外，在除結(jié)腸癌外的多種腫瘤中，同樣也發(fā)現(xiàn)了由包括APC、KRAS、SMAD4 以及TP53 在內(nèi)的基因突變導(dǎo)致的細胞內(nèi)信號通路改變，提示這些基因發(fā)生突變引起的細胞內(nèi)信號通路改變是關(guān)鍵的促癌信號，與腫瘤的類型無關(guān)[6]。

1.2 突變基因與多步驟腫瘤發(fā)生

近年來由于正常腸道干細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，使得能夠在體外培養(yǎng)的條件下模擬體內(nèi)環(huán)境，證實這些突變基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用。研究證實在體外培養(yǎng)的正常腸道類器官通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)的APC、KRAS、SMAD4以及TP53 中的4 個基因或5 個基因發(fā)生突變，誘導(dǎo)系膜細胞表型轉(zhuǎn)換，再將這些發(fā)生表型轉(zhuǎn)換的類器官移植到正常的小鼠皮下，可以導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生。這些研究結(jié)果進一步證實了多步驟腫瘤發(fā)生這一概念，盡管還存在著其他導(dǎo)致腫瘤形成的可能機制存在，例如表觀遺傳的改變等[7]。

2 p53 突變與人結(jié)腸癌

2.1 p53 突變導(dǎo)致結(jié)腸癌的可能原因

研究顯示p53 種系突變與家族性癌癥綜合征李-佛美尼綜合征（Li-Fraumeni syndrome）密切相關(guān)，李-佛美尼綜合征是一種伴發(fā)多種起源于不同器官癌癥的臨床綜合征，提示p53 在多種癌癥等發(fā)生中均起著抑癌等作用。與之一致的是，在胰腺癌中p53 突變是最常見的致癌突變，占到所有突變基因的43%[8]。在非高突變型結(jié)腸癌中，p53 的突變率大約在55%-60%之間，是這一類型的結(jié)腸癌中突變率第2 位的基因，突變率占第1位的是APC 基因，其突變率達到了80%以上，但在高突變型結(jié)腸癌中，TP53 的突變率大致在20%左右[9]。

研究顯示，p53 發(fā)生突變與多種癌癥的預(yù)后不佳密切相關(guān)，這其中就包括結(jié)腸癌。研究同時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移時，p53 的突變率會增加至80%以上。另外，p53 的突變并不發(fā)生在結(jié)腸瘤樣息肉階段，在此階段p53 的突變率大致在15%-30%左右[10]。這些結(jié)果提示p53 突變可能在結(jié)腸癌的中晚期起著促癌作用，例如從結(jié)腸腺瘤到結(jié)腸腺癌的轉(zhuǎn)變，以及結(jié)腸癌的遠端轉(zhuǎn)移。

包括DNA 損傷、端粒酶丟失、低氧以及營養(yǎng)缺乏在內(nèi)的細胞應(yīng)激和促癌信號通路的激活、p53活化等會導(dǎo)致細胞周期停滯、衰老和細胞凋亡。而這些細胞應(yīng)激性反應(yīng)都受到p53 調(diào)控的下游基因調(diào)控，例如p53 下游的p21、Tiger、PAI-1 基因。當(dāng)p53 失去轉(zhuǎn)錄活性的時候，會導(dǎo)致這些受到p53 調(diào)控的基因過度激活，而這可能是p53 突變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的可能原因之一。

2.2 p53 錯義突變與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展

研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中約74%左右的TP53突變?yōu)殄e義突變，即在DNA 綁定結(jié)構(gòu)域內(nèi)發(fā)生氨基酸替換，其中替換發(fā)生頻率最高的氨基酸殘基是R175、G245、R248、R249、R273 和R282[11]。在正常情況下，p53 在空間上的結(jié)構(gòu)為一個四聚體，而發(fā)生突變后，將破壞這一結(jié)果，影響其正常的功能。研究顯示，當(dāng)p53 錯義突變發(fā)生在小鼠R173H 位點時（人相對應(yīng)的位點為R175H）會減弱抗癌治療恢復(fù)的野生型p53 的功能[11]。但是，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在這些頻率最高位點的TP53錯義突變導(dǎo)致的促癌作用可能通過獲得某些功能所引起，盡管每一個位點發(fā)生的錯義突變在腫瘤的發(fā)生中均有其特定的作用。此外，這些TP53 的錯義突變與結(jié)腸癌的預(yù)后成明顯的正相關(guān)，提示當(dāng)p53 發(fā)生錯義突變獲得某些功能時在腫瘤的進展中可能起著重要的作用。需要注意的是，在非高頻率突變型結(jié)腸癌中，超過80%的腫瘤通過雜合攜帶p53 錯義突變而喪失其原本的野生型功能[12]。綜上所述，這些結(jié)果提示p53 在最常見的位點發(fā)生錯義突變導(dǎo)致其獲得某些功能，促進結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸腺癌的轉(zhuǎn)變，而額外的雜合錯義突變導(dǎo)致的p53 功能喪失在腫瘤發(fā)生晚期會導(dǎo)致更惡性的表現(xiàn)。

在小鼠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的可以獲得功能性的p53 錯義突變。過表達R172H或R270H 突變（人相對應(yīng)的位點為R175H 和R273H）的Trp53 轉(zhuǎn)基因小鼠會自發(fā)腸道和肺部腫瘤，其機制與p53 在細胞核內(nèi)聚集相關(guān)，但敲除p53 基因不會發(fā)生自發(fā)性腫瘤。除此之外，還發(fā)現(xiàn)了其他一些與p53 錯義突變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的機制。例如，發(fā)現(xiàn)p53 突變通過促進Rub 耦合蛋白與整合素蛋白以及肝生長因子受體結(jié)合，導(dǎo)致EGFR/整合素信號通路和肝生長因子信號通路的激活，引起腫瘤細胞侵襲和遷移能力增強[12]。p53 突變還可以通過結(jié)合p63 和p73，加速轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移以及PDGFβ 信號通路。p53 突變增加干細胞池和腸內(nèi)皮細胞的數(shù)量，而這可能導(dǎo)致腫瘤增生能力增強。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)p53 突變同樣可以通過表觀遺傳改變介導(dǎo)大量的基因表達異常，這其中包括促癌基因。當(dāng)p53 發(fā)生錯義突變時（包括發(fā)生在R175H 和R273H 的錯義突變），可以通過與SWI/SN 染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體結(jié)合或者促進MLL1、MLL2 和MOZ 甲基化和乙?；M蛋白，進一步通過表達遺傳促進啟動子的激活導(dǎo)致整個基因組轉(zhuǎn)錄異常。這些結(jié)果提示在p53 突變高頻位點發(fā)生突變，可以通過調(diào)整整個染色體的穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的激活，上調(diào)促癌基因的表達導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生。

2.3 p53 突變丟失野生型功能與結(jié)腸癌

APC 基因突變激活Wnt 信號通路在結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。在正常的腸系膜上皮細胞中，來源于基質(zhì)細胞產(chǎn)生的Wnt 的配體刺激Wnt 上的卷曲受體，破壞APC、β-連環(huán)蛋白和GSK3β 復(fù)合體，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的降解減少。因此，Wnt 信號通路維持β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性，促進其向細胞核內(nèi)的聚集，與TCF形成復(fù)合體，進一步促進Wnt 信號通路下游基因的表達，以維持干細胞的正常數(shù)量和功能[13]。因此，APC 基因突變通過過度持續(xù)激活腸上皮細胞內(nèi)Wnt 信號通路促進腸道癌癥的發(fā)生和發(fā)展。

在使用藥物（APCmin）或者基因敲除（APCΔ716）誘導(dǎo)APC 基因的小鼠模型中，持續(xù)激活Wnt 信號通路，會導(dǎo)致小鼠自發(fā)形成多發(fā)性腸息肉。為研究p53 突變引起的野生型p53 功能缺失在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，研究者們構(gòu)建了一些突變小鼠。在以c57bl/6 和129 雜合的基因背景APCmin 小鼠中加入無效等位基因的p53并沒有導(dǎo)致結(jié)腸癌的進展加重[14]。有趣的是，APCminTrp53-/-基因背景為純c57bl/6 小鼠時，結(jié)腸腫瘤的侵襲能力減弱。這些研究結(jié)果提示，p53突變引起的野生型p53 功能缺失在結(jié)腸癌早期的侵襲、轉(zhuǎn)移中可能不起重要的作用，同時小鼠基因背景不一致也會導(dǎo)致結(jié)果不同。

2.4 p53 錯義突變在結(jié)腸癌進展中的作用

在純合子Trp53R270H/R270H小鼠中，p53 持續(xù)在細胞核內(nèi)聚集。來源于APCΔ716 小鼠的類器官由于Wnt 信號通路的持續(xù)激活和分化障礙，其大體形態(tài)表現(xiàn)為橢圓形，但是當(dāng)p53 缺失時，這一表型不發(fā)生改變[15]。相反，來源于純合子Trp53R270H/R270H小鼠的類器官則表現(xiàn)出與Trp53 缺失小鼠完全不同的表型改變。這種腫瘤的腺狀結(jié)構(gòu)與Wnt 信號通路激活的程度有關(guān)。這些與p53 R270H 位點突變的蛋白表達水平相關(guān)的腫瘤表型可以通過使用異羥肟酸顯著抑制，異羥肟酸是一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑，其通過Mdm2 介導(dǎo)的泛素化促進降解發(fā)生突變的p53 蛋白。

另外，與皮下移植來源于APCΔ716Trp53Null小鼠的類瘤組織相比，移植APCΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的類瘤組織表現(xiàn)出更嚴重的侵襲表型，例如上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中細胞的形態(tài)表現(xiàn)出更多的分支和細胞外有大量的纖維環(huán)境和活化的成纖維細胞。當(dāng)p53 發(fā)生突變的位點在R273H 時，腫瘤組織也表現(xiàn)出同樣的形態(tài)，即在腫瘤組織周圍存在大量的細胞分支[16]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤外環(huán)境中存在大量的纖維，可以促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。另外，結(jié)腸癌周圍有大量的變性纖維基質(zhì)，與侵襲能力增強和預(yù)后不佳呈正相關(guān)。因此，p53發(fā)生錯義突變促進結(jié)腸癌侵襲能力增強的機制可能與形成復(fù)雜的囊性結(jié)構(gòu)，獲得浸潤能力以及誘導(dǎo)形成纖維基質(zhì)形成相關(guān)。

2.5 p53 突變與炎癥信號通路激活

大量的流行病學(xué)和基因組學(xué)研究證實，炎癥反應(yīng)會促進結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展，提示炎癥可能是結(jié)腸癌治療的一個潛在靶點。在腫瘤微環(huán)境中，有大量的巨噬細胞浸潤和激活，這些巨噬細胞被稱為腫瘤相關(guān)的巨噬細胞，表達CSF-1 和CCL2，而CSF-1 和CCL2 可能與腫瘤的侵襲和浸潤有關(guān)[17]。另外，在化學(xué)刺激誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎-結(jié)腸癌模型中[18]，巨噬細胞會釋放大量的細胞因子刺激腫瘤細胞、激活NF-κB 和Stat3 信號通路。但是，NF-κB 信號通路在腫瘤細胞中激活的機制仍然沒有詳細闡明。研究發(fā)現(xiàn)，p53 錯義突變可能在結(jié)腸癌中NF-κB信號通路的激活起著重要的作用。例如，當(dāng)p53 發(fā)生錯義突變丟失其野生型的功能時，會加速化學(xué)刺激誘導(dǎo)結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增加[19]。其機制可能與Trp53功能障礙時，抑制閉合蛋白和密封蛋白的表達，導(dǎo)致上皮的屏障功能障礙有關(guān)。而細菌的產(chǎn)物，例如脂多糖，會滲透進入結(jié)腸的固有層，導(dǎo)致結(jié)腸內(nèi)固有巨噬細胞的激活，進一步導(dǎo)致NF-κB信號通路在腫瘤細胞和間質(zhì)細胞的激活[20]。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)R127H 位點發(fā)生p53 突變時，與化學(xué)刺激誘導(dǎo)的潰瘍型結(jié)腸炎小鼠模型中腸道炎癥持續(xù)激活有關(guān)，這會進一步導(dǎo)致潰瘍相關(guān)的結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展[21]。TNF-α 激活的NF-κB 信號通路會上調(diào)其下游靶基因在結(jié)腸上皮細胞內(nèi)的表達。當(dāng)p53 發(fā)生錯義突變時，NF-κB 結(jié)合下游靶基因啟動子的時間延長，導(dǎo)致炎癥細胞因子的持續(xù)釋放。在人類潰瘍相關(guān)的結(jié)腸癌中，TP53 突變是炎癥潰瘍中最常見的突變。因此，結(jié)腸潰瘍中發(fā)生p53 錯義突變可能是導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的原因之一，其機制可能與促進炎癥反應(yīng)有關(guān)。

Nakayama[22]等人通過使用來自ApcΔ716Trp53+/+，ApcΔ716Trp53Null，和ApcΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的結(jié)腸腫瘤組織進行轉(zhuǎn)錄組基因測序，發(fā)現(xiàn)大約有350 個基因特異性的在ApcΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的結(jié)腸腫瘤組織中表達上調(diào)。進一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Wnt 信號通路和NF-κB信號通路在結(jié)腸癌組織中通過p53 突變R270 依賴性的方式激活。Nakayama 等人同樣發(fā)現(xiàn)啟動子結(jié)合能力在ApcΔ716Trp53R270H/R270H小鼠的接觸腫瘤中顯著增強，提示p53 突變打開了基因啟動子的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Wnt 信號通路和NF-κB 信號通路激活。p53 突變引起的Wnt 信號通路和NF-κB信號通路激活可能會維持腫瘤細胞的干細胞特性或未分化狀態(tài)。

3 小結(jié)

深入研究結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的病理生理機制，對尋找新的潛在治療靶點具有極其重要的理論和現(xiàn)實意義，是目前結(jié)腸癌研究領(lǐng)域的熱點和難點問題。研究發(fā)現(xiàn)，促癌基因或抑癌基因表達和/或功能的異常在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及化療藥物耐受和預(yù)后中起著重要的作用。隨著近年來包括腫瘤類器官的培養(yǎng)技術(shù)在內(nèi)的生物技術(shù)和基因測序技術(shù)突飛猛進的發(fā)展，人們能夠應(yīng)用多種敲基因或者轉(zhuǎn)基因小鼠模型來研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的機制。通過這些小鼠模型，研究者們發(fā)現(xiàn)持續(xù)存在的p53 錯義突變，例如發(fā)生在R270H（人為R283H）位點的突變，在黏膜下層浸潤，包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移中起著極其重要的作用。當(dāng)p53 錯義突變合并其他基因突變時，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移會更加厲害。盡管近年來報道了一些p53 導(dǎo)致癌癥發(fā)生發(fā)展的機制，但是p53 突變導(dǎo)致的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變可能是導(dǎo)致促癌基因廣泛表達的最關(guān)鍵原因。在結(jié)腸癌細胞中，Apc 基因突變激活Wnt 信號通路，同時炎癥微環(huán)境也會導(dǎo)致NF-κB 信號通路的激活。另外，Wnt 信號通路和NF-κB 信號通路的相互作用會增強腫瘤細胞的干細胞特性和未分化狀態(tài)。因此，p53 錯義突變導(dǎo)致的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)打開，導(dǎo)致Wnt 信號通路和NF-κB 信號通路處于持續(xù)激活狀態(tài)是導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要機制。

重要的是，p53 錯義突變后在細胞核的聚集似乎是導(dǎo)致促癌基因表達和腫瘤發(fā)生的重要因素。盡管丟失野生型功能的p53 突變可能會導(dǎo)致p53穩(wěn)定性增加，但有研究顯示p53 突變的穩(wěn)定性以及在核內(nèi)聚集的能力仍然受到細胞內(nèi)信號的調(diào)控。因此，需要進一步研究p53 突變后的穩(wěn)定性以及其在核內(nèi)聚集調(diào)控的細胞內(nèi)信號通路。目前對于結(jié)腸癌的治療一直未能找到十分有效的藥物，傳統(tǒng)的手術(shù)切除和化療藥物治療并沒有給結(jié)腸癌患者帶來明顯的獲益，因此，迫切需要尋找新的結(jié)腸癌潛在治療靶點，而這可以作為以后干預(yù)結(jié)腸癌的一個潛在治療靶點。