唐玉玲 王 進(jìn) 邱業(yè)峰 袁 征

(軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心，北京 100071)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一類包括關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜以及關(guān)節(jié)周圍肌肉等結(jié)構(gòu)發(fā)生病變所致的關(guān)節(jié)退行性疾病[1-2]。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛及壓痛、關(guān)節(jié)僵硬及腫脹、關(guān)節(jié)活動摩擦、關(guān)節(jié)畸形以及肌肉萎縮等，常導(dǎo)致患者活動障礙甚至發(fā)生殘疾[3]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：到2020年OA可能成為人類第四大致殘疾病[4]。隨著全球人口老齡化和肥胖的加劇，OA的發(fā)生更為普遍，不僅嚴(yán)重影響患者個人身心健康、對全球公共衛(wèi)生事業(yè)及現(xiàn)代社會經(jīng)濟(jì)也造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[5-6]。OA動物模型的研制對研究OA發(fā)生發(fā)展中的遺傳機(jī)制、預(yù)防以及治療都有著重要意義。目前OA動物模型主要包括三類：自發(fā)性O(shè)A動物模型、誘發(fā)性O(shè)A動物模型以及轉(zhuǎn)基因OA動物模型[7]。

1 自發(fā)性O(shè)A動物模型

自發(fā)性O(shè)A動物模型指不經(jīng)過人為干預(yù)，在自然條件下發(fā)生OA的動物。已有的自發(fā)性O(shè)A動物模型中，Hartley豚鼠模型[8]在18～22月齡間發(fā)生中至重度的骨關(guān)節(jié)炎；C57小鼠模型中2月齡小鼠OA發(fā)生率為25%，16月齡時達(dá)80%，但缺乏人類OA的關(guān)節(jié)軟骨纖維化的表型[9]。然而，人為喂養(yǎng)高脂飼料或是增加運動負(fù)荷后能增加C57小鼠的OA自發(fā)率[10-11]。其次，STR/ort小鼠也是公認(rèn)的自發(fā)性O(shè)A動物模型[12-14]，其膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)和顳下頜關(guān)節(jié)等均是OA的好發(fā)部位。此外，來源于B6C3F1小鼠的BCBC/Y小鼠[15]也能夠自發(fā)發(fā)生OA。這一小鼠踝關(guān)節(jié)發(fā)生典型的OA損傷表型，關(guān)節(jié)腫脹畸形，關(guān)節(jié)軟骨變薄并產(chǎn)生裂隙及侵蝕，關(guān)節(jié)邊緣形成骨贅，并且隨著鼠齡增長小鼠常發(fā)生癱瘓。

2 誘發(fā)性O(shè)A動物模型

誘發(fā)性O(shè)A動物模型指通過人為操作對動物骨關(guān)節(jié)及周圍組織進(jìn)行手術(shù)或非手術(shù)的干預(yù)從而誘導(dǎo)OA發(fā)生的動物。誘發(fā)性O(shè)A動物模型在大鼠、小鼠、兔、犬、豬、綿陽、馬等多個不同物種中都有報道[16]。按造模方法不同，誘發(fā)性O(shè)A動物模型可分為經(jīng)典的Hulth模型[17-18]、前交叉韌帶橫斷模型[19]、半月板切除模型[20]、關(guān)節(jié)刻痕法模型[21]、切斷臀肌法模型[22]、骨內(nèi)高壓模型[23]、卵巢切除術(shù)模型[24]等手術(shù)法造模模型及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射模型[25]、關(guān)節(jié)制動法模型[26]等非手術(shù)法造模模型。

2.1 手術(shù)法造模模型

經(jīng)典的Hulth模型、前交叉韌帶橫斷模型、半月板切除模型等是對半月板、韌帶等關(guān)節(jié)內(nèi)單個部位或多個部位進(jìn)行手術(shù)切除從而誘導(dǎo)OA發(fā)生。此類模型造模成功率高，可重復(fù)性高，適用于創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎的研究；但手術(shù)創(chuàng)傷對關(guān)節(jié)損害大，且易引發(fā)術(shù)后感染導(dǎo)致炎癥等。關(guān)節(jié)刻痕法模型則只是在關(guān)節(jié)股骨上刻痕，創(chuàng)傷較小且關(guān)節(jié)炎癥輕微，適用于早期OA的研究，但此類模型造模周期稍長。切斷臀肌法模型、骨內(nèi)高壓模型、卵巢切除術(shù)模型等的共同點是手術(shù)部位選擇非關(guān)節(jié)組織、避免了關(guān)節(jié)的損傷。切斷臀肌法模型是通過肌肉損傷造模，骨內(nèi)高壓模型通過結(jié)扎或切斷某些靜脈干擾關(guān)節(jié)的血液循壞進(jìn)而造模，而卵巢切除術(shù)模型則是通過切除卵巢來模擬絕經(jīng)后的骨關(guān)節(jié)炎。這三種模型分別適用于研究肌肉損傷、血液供應(yīng)以及雌激素等因素對OA發(fā)生的影響，應(yīng)用面窄，不適合廣泛的OA相關(guān)研究。

2.2 非手術(shù)法造模模型

非手術(shù)法造模模型主要包括關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射模型、關(guān)節(jié)制動法模型兩類。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射模型是通過向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射能夠損害關(guān)節(jié)的藥物，如木瓜蛋白酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶、菲律賓菌素、碘醋酸鹽、碘乙酸鹽等進(jìn)而誘發(fā)OA的發(fā)生。關(guān)節(jié)腔注射造模具有微創(chuàng)、易于操作的優(yōu)點，但藥物的劑量難以掌控易造成誤差。關(guān)節(jié)制動法模型是采用固定或牽引的方式對動物的關(guān)節(jié)進(jìn)行機(jī)械性制動從而造成關(guān)節(jié)損傷。這種造模方式同樣避免了手術(shù)創(chuàng)傷，且模型與人類缺乏運動所致OA有一定相似性；但目前缺乏完美的固定設(shè)施及材料且制動操作復(fù)雜，難以控制。此外，寒冷刺激、飲食誘導(dǎo)、運動性損傷等方式也可以誘發(fā)OA模型，此類模型也屬于非手術(shù)法造模模型，但模型成因較為特殊、造模耗時長且應(yīng)用不廣泛[16]。

3 轉(zhuǎn)基因OA動物模型

轉(zhuǎn)基因OA動物模型指利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合基因編輯技術(shù)等將外源基因插入動物基因組或?qū)游镒陨砘蜻M(jìn)行突變、敲除等改變而導(dǎo)致OA發(fā)生的動物。已報道的轉(zhuǎn)基因OA動物模型幾乎全是利用小鼠造模[27]。根據(jù)不同的基因改造策略及改造結(jié)果，可將轉(zhuǎn)基因OA小鼠模型分為三類：基因突變小鼠模型、全身性敲除小鼠模型以及條件性敲除小鼠模型。下面對不同轉(zhuǎn)基因OA小鼠模型逐一進(jìn)行介紹。

3.1 基因突變小鼠模型

Col2a1點突變轉(zhuǎn)基因小鼠：Arita等[28]向FVB/N小鼠外源導(dǎo)入了突變(第519位精氨酸更替為半胱氨酸)的人類Col2a1基因從而構(gòu)建了Col2a1基因點突變的轉(zhuǎn)基因小鼠。這一突變策略模擬了臨床家族性O(shè)A病人中Col2a1基因第519位精氨酸更替為半胱氨酸的這一突變[29]。Col2a1基因點突變轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)骨骼發(fā)育延遲、II型膠原纖維密度減少，軟骨發(fā)育異常等OA樣表型[28]。

3.2 全身性基因敲除小鼠模型

3.2.1Blotchy轉(zhuǎn)基因小鼠模型：早在1977年，Silberberg等[30]報道了Blotchy轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其X染色體上“Mottled”基因位點攜帶了導(dǎo)致膠原蛋白和彈性蛋白交聯(lián)缺陷的基因[31-32]。他們發(fā)現(xiàn)Blotchy轉(zhuǎn)基因半合子雄性小鼠除了發(fā)生肺氣腫和主動脈瘤，還有典型的骨關(guān)節(jié)炎表征。1996年，Glasson等[33]利用同一小鼠模型的雜合子雌性小鼠展開研究，發(fā)現(xiàn)Blotchy雌鼠也呈現(xiàn)軟骨損傷、蛋白聚糖嚴(yán)重缺失等OA表型。

3.2.2Col2a1相關(guān)的轉(zhuǎn)基因小鼠：1992年，Metsaranta等[34]在B6D2F1小鼠中敲除Ⅱ型膠原基因的第7外顯子，小鼠出生即死亡，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)及膠原纖維減少，生長板結(jié)構(gòu)紊亂、四肢、胸腔、顱骨等畸形。

1993年，Helminen等[35]發(fā)現(xiàn)Col2a1缺陷基因轉(zhuǎn)基因小鼠也具有OA特征，Vandenberg等[36]向FVB/N小鼠外源導(dǎo)入了一段刪除12個外顯子的人COL2A1基因，這一缺陷基因編碼一條缺失291個氨基酸的短肽鏈，它與小鼠內(nèi)源性表達(dá)的全長肽鏈同時存在導(dǎo)致前膠原纖維無法形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)進(jìn)而被降解，從而導(dǎo)致Col2a1的全身刪除。Col2a1缺陷基因轉(zhuǎn)基因小鼠的表型呈現(xiàn)多樣化：15%的小鼠發(fā)生腭裂后死亡；存活的小鼠在1 d到3月齡間發(fā)生不同程度的軟骨基質(zhì)膠原纖維變少、軟骨細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等軟骨發(fā)育異?，F(xiàn)象，小鼠的質(zhì)量及骨密度都減少；15月齡小鼠則發(fā)生典型的OA樣軟骨退行性病變[35]。

1995年，Li等[37]通過破壞Col2a1基因的第35外顯子構(gòu)建了Col2a1基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。純合小鼠出生前后致死，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞缺乏細(xì)胞外基質(zhì)及膠原纖維，長骨缺失軟骨內(nèi)骨及骨骺生長板，但顱骨及肋骨正常。利用這一模型，Lapvetelainen等[38]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)雜合小鼠更易發(fā)生膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎。

3.2.3Col9al敲除小鼠:1994年，F(xiàn)assler等[39]構(gòu)建了Col9al基因敲除小鼠。IX型膠原是由α1、α2及α3三條肽鏈組成的三聚體，研究者們通過破環(huán)α1鏈的第8外顯子得到Col9al基因敲除小鼠，小鼠發(fā)生人OA樣退行性關(guān)節(jié)疾病[39]。隨后，Kimura等[40]發(fā)現(xiàn)這一突變小鼠的脊椎也發(fā)生類似的退行性病變。Hu等[41]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Col9al基因敲除小鼠的膝關(guān)節(jié)及顳下頜關(guān)節(jié)也發(fā)生年齡依賴性的OA樣病變。Col9al基因敲除小鼠3月齡時開始出現(xiàn)表型，6月齡小鼠關(guān)節(jié)軟骨蛋白聚糖及IX型膠原降解嚴(yán)重，基質(zhì)金屬蛋白酶及盤狀蛋白域受體2表達(dá)增加，此外股骨和脛骨的關(guān)節(jié)軟骨力學(xué)結(jié)構(gòu)特性及滲透性也發(fā)生改變。

3.2.4Del1敲除小鼠:2000年，Saamanen等[42]報道了Del1位點插入6個拷貝的突變Col2轉(zhuǎn)基因的小鼠模型，Del1雜合小鼠發(fā)生軟骨關(guān)節(jié)退化及侵蝕、半月板退化、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)礦化、囊腫、軟骨下骨暴露等OA樣病變。

2016年，王振等[43]發(fā)現(xiàn)Del1基因敲除小鼠更易引發(fā)嚴(yán)重的OA。利用的小鼠模型是Hidai等[44]于1998年構(gòu)建的Del1-LacZ敲入小鼠，其構(gòu)建策略是在小鼠的Del1位點插入LacZ基因，導(dǎo)致Del1遭到破壞而發(fā)生敲除以及LacZ的表達(dá)。這一小鼠的骨骼密度和形態(tài)正常，耳朵和膝關(guān)節(jié)的軟骨變薄，在損傷壓力下更易導(dǎo)致OA的發(fā)生[43]。

3.2.5雙鏈蛋白多糖/纖調(diào)蛋白聚糖敲除小鼠:2003年，Young等[45]發(fā)現(xiàn)雙鏈蛋白多糖基因敲除小鼠、纖調(diào)蛋白聚糖基因敲除小鼠以及雙糖鏈蛋白多糖/纖調(diào)蛋白聚糖的雙基因敲除小鼠都會發(fā)生早發(fā)性O(shè)A，雙基因敲除小鼠的OA表型發(fā)生更早且更嚴(yán)重。

3.3 條件性基因敲除小鼠模型

3.3.1β-catenin條件性敲除小鼠：2009年，朱梅等[46]特異性敲除關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞β-catenin的第3外顯子的一個拷貝，導(dǎo)致小鼠發(fā)生人OA樣表型。研究者們將Col2a1-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠[47-48]與β-cateninfx(Ex3)/fx(Ex3)基因打靶小鼠[49]交配得到Col2a1-CreERT2;β-cateninfx(Ex3)/wt小鼠，經(jīng)tamoxifen誘導(dǎo)后β-catenin第3外顯子被敲除。小鼠5月齡時關(guān)節(jié)軟骨減少，8月齡時觀察到關(guān)節(jié)表面纖維性顫動、裂陷、軟骨骨贅形成等現(xiàn)象。同時，小鼠關(guān)節(jié)軟骨中Aggrecan、Mmp-9、Mmp-13、Alp、Oc、ColX等多種軟骨細(xì)胞標(biāo)志物以及Bmp2的表達(dá)都顯著上升[46]。

3.3.2EFNB2條件性敲除小鼠：2016年，Valverde-Franco等[50]將Col2a1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與EFNB2fx/fx基因打靶小鼠交配得到軟骨特異性EFNB2純合敲除小鼠(Col2a1-Cre;EFNB2fx/fx)，小鼠軟骨細(xì)胞EFNB2的第1外顯子被敲除。研究者們分析EFNB2敲除小鼠發(fā)現(xiàn)：剛出生時小鼠生長板X型膠原蛋白表達(dá)增加、肥大區(qū)紊亂、礦化減少；15日齡小鼠軟骨-骨連接處VEGF和TRAP的表達(dá)顯著下降、骨體積和骨小梁厚度減少導(dǎo)致第二骨化中心形成延遲；21日齡及8周齡小鼠骨密度下降；12月齡小鼠膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)均表現(xiàn)出OA的表型。

3.3.3DOT1L條件性敲除小鼠：2017年，Monteagudo等[51]發(fā)現(xiàn)DOT1L具有維持軟骨組織穩(wěn)態(tài)及預(yù)防OA發(fā)生的作用。研究者們抑制DOT1L活性后野生小鼠發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎，利用軟骨細(xì)胞表達(dá)的Col2a1-Cre敲除DOT1L第2外顯子后，小鼠關(guān)節(jié)軟骨X型膠原和MMP13表達(dá)增加，關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)受到影響。同時，小鼠還出現(xiàn)骨骼生長停滯，生長板前肥大區(qū)發(fā)生紊亂等表型。

3.3.4Pten條件性敲除小鼠：2019年，謝婧等[52]發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨中持續(xù)激活A(yù)kt信號導(dǎo)致小鼠發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎。研究中同時使用組成型Col2a1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠及誘導(dǎo)型Col2a1-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠分別與第4、5外顯子被錨定的Ptenfl/fl小鼠交配得到軟骨細(xì)胞特異性Pten敲除小鼠。Col2a1-Cre；Ptenfl/fl小鼠5月齡時蛋白聚糖減少，關(guān)節(jié)軟骨厚度減少、關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破損；8月齡時關(guān)節(jié)表面變粗糙并發(fā)生侵蝕；10月齡時小鼠軟骨嚴(yán)重缺損；隨著鼠齡增加，關(guān)節(jié)軟骨缺損嚴(yán)重，軟骨下骨和滑膜皆發(fā)生病變并形成骨贅。為排除Col2a1-Cre；Ptenfl/fl小鼠中生長板缺損造成的影響，研究者們進(jìn)一步在Col2a1-CreERT2；Ptenfl/fl小鼠中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)性Ptenfl/fl敲除小鼠8月齡也出現(xiàn)了明顯的OA的表型。

目前轉(zhuǎn)基因OA動物模型多為全身性的突變或敲除小鼠，條件性基因敲除小鼠模型仍然缺乏。全身性的突變或敲除的OA小鼠模型除了有部分類似OA的病理表型外，多數(shù)還同時發(fā)生其他器官或組織的缺陷，這對研究OA的治病機(jī)制或是治療方法等具有一定的影響。條件性基因敲除小鼠模型在軟骨細(xì)胞中特異性敲除特定基因進(jìn)而研究其功能，這對探索OA發(fā)生發(fā)展的過程及機(jī)制有很好的促進(jìn)作用，但目前這類模型的數(shù)量有限，OA的致病機(jī)理及治療機(jī)制等相關(guān)研究仍有很大的空白，研制新的條件性轉(zhuǎn)基因OA小鼠模型具有重要意義。

4 小結(jié)

人類OA的發(fā)病原因復(fù)雜，與年齡、肥胖、炎癥、創(chuàng)傷及遺傳因素等都有重要聯(lián)系[53-54]。OA動物模型的應(yīng)用及研究對探究人類OA的致病機(jī)理、預(yù)防及治療等具有不可替代的作用。任何動物模型的研制都需要符合相似性、重復(fù)性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性、符合動物實驗倫理和3Rs理論等多項原則。理想的OA模型最重要的標(biāo)準(zhǔn)是能夠最大程度模擬人類OA的發(fā)生發(fā)展過程，即組織病理、細(xì)胞狀態(tài)、相關(guān)信號通路及分子標(biāo)志物等多方面的變化都與人類OA相一致。此外，還需要符合周期短、費用低、操作便利、表型穩(wěn)定可重復(fù)、動物福利倫理等多種要求。然而，目前大部分OA動物模型只能模擬臨床OA的部分癥狀，不同的OA動物模型都有自己獨特的優(yōu)勢，也存在局限性。自發(fā)性O(shè)A動物模型避免了人為損傷，但造模周期長、費用高。誘發(fā)性O(shè)A動物模型中，手術(shù)法會對動物造成創(chuàng)傷，穩(wěn)定性難以維持；非手術(shù)法藥物種類及劑量、操作方式及時間都難以控制；多數(shù)誘發(fā)性O(shè)A動物模型適用領(lǐng)域都比較窄[55]。相對自發(fā)性誘發(fā)性造模來說，轉(zhuǎn)基因造模不僅能夠避免手術(shù)創(chuàng)傷，減輕模型動物的痛苦，還能彌補(bǔ)其他方法造模的不穩(wěn)定性，具有其他造模方法無法比擬的特點和優(yōu)勢。目前多種轉(zhuǎn)基因OA模型被成功研制并在OA的致病機(jī)理、藥物篩選、預(yù)防及治療等相關(guān)研究發(fā)揮作用，也是未來OA模型研制的主要方向。

除了運用單一的造模方法，很多OA的相關(guān)研究中結(jié)合使用了多種造模方法，如多部位手術(shù)誘發(fā)造模[56]、轉(zhuǎn)基因模型結(jié)合誘發(fā)性干預(yù)[43]、多基因敲除造模等[45]。鑒于目前的OA動物模型無法模擬人類OA的所有特征，研究者需要根據(jù)自己的研究領(lǐng)域及研究目的選擇合適的造模策略，轉(zhuǎn)基因OA模型因其獨特的優(yōu)越性而具備很重要的發(fā)展?jié)摿?。此外，為最大程度模擬人類臨床OA病理特征，OA動物模型的研制必然走向以轉(zhuǎn)基因造模為主、同時結(jié)合其他造模方法綜合運用的趨勢。