孟凡飛，史套興，宋倫

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850

內(nèi)在的生理活動與外在的行為活動在時間上與日出日落24 h 的周期相一致的節(jié)律活動叫做晝夜節(jié)律，這種晝夜節(jié)律影響著幾乎所有單細(xì)胞生物、植物和動物。晝夜節(jié)律產(chǎn)生的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是生物鐘。哺乳動物的中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），是生物鐘系統(tǒng)的主起搏點[1]，在晝夜節(jié)律的產(chǎn)生、維持和調(diào)控中起主導(dǎo)作用。過去幾十年中，各種研究已表明生物鐘同樣也存在于心、肺、腎、肝、骨骼肌等外周組織器官，稱之為外周生物鐘[2]。外周生物鐘可以受到中樞生物鐘通過神經(jīng)、體液等方式直接或間接的調(diào)控，同時也能擺脫中樞生物鐘的調(diào)控獨立運行，起到生物鐘系統(tǒng)次起搏點的作用。在自然狀態(tài)下，生物鐘受到光照、溫度、食物以及化學(xué)物質(zhì)刺激等環(huán)境因素的作用影響，生物鐘時相以及相關(guān)基因的表達強度發(fā)生改變，來與外界環(huán)境保持同步。

生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心基因包括clock（cir?cadian locomotor output cycles kaput）、bmal1（brain and muscle ARNT-like protein 1）、cry2（cryptochrome 2）、per2（period 2）、rev-erbα（nucle?ar receptor subfamily 1 group D member 1，NR1D1）和rorα（RAR-related orphan receptor α）等[3]。其中在生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起主導(dǎo)作用的是2 個PAS-bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員CLOCK 和BMAL1。CLOCK 與BMAL1 形成異二聚體，作用于cry、per、rev-erbα、rorα等靶基因的 E 反應(yīng)元件（E box，CACGTG）并啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程[4]。cry基因的表達產(chǎn)物 CRY（Cryptochrome 1 和 2）和per基因的表達產(chǎn)物 PER（Period 1、2 和 3）可形成復(fù)合物，隨著蛋白產(chǎn)物的不斷積聚，積累到一定程度時可作為負(fù)性元件抑制CLOCK-BMAL1 異二聚體的轉(zhuǎn)錄活性，進而抑制cry和per基因的轉(zhuǎn)錄[5]。同時CLOCK-BMAL1 異二聚體也可以誘導(dǎo)視黃酸相關(guān)的孤束核受體 REV-ERBα（NR1D1）和 RORα（NR1F1）的表達，REV-ERBα可以與bmal1啟動子區(qū)結(jié)合阻遏BMAL1 的表達，RORα可以作為正向調(diào)節(jié)因子促進BMAL1 的表達[6]。

1 骨骼肌中相關(guān)生物鐘基因的表達

骨骼肌兼負(fù)運動、代謝、內(nèi)分泌等多重生理功能，其功能機制涉及中樞生物鐘的直接調(diào)控與其內(nèi)部自身內(nèi)源性生物鐘的自我調(diào)控。骨骼肌晝夜節(jié)律現(xiàn)象的存在是從大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成存在24 h 的周期性變化中首次發(fā)現(xiàn)的，之后骨骼肌中晝夜節(jié)律的振蕩器被Zylka 等提出[7]。2007年第一個骨骼肌生理節(jié)律轉(zhuǎn)錄組被Takahashi 提出，在小鼠中有215 個、大鼠中有107 個基因的表達存在晝夜節(jié)律性[8]。這些基因不僅包括在骨骼肌中起主要調(diào)控作用的生物鐘基因bmal1、cry2、per2、rev-erbα和rorα以及相關(guān)的鐘控基因dbp（al?bumin D-site-binding protein）和tef1（thyrotroph embryonic factor 1），同時也包括與骨骼肌功能相關(guān)的基因myod1（myogenic determination gene 1）等以及與骨骼肌能量代謝相關(guān)的基因pgc-1β（proliferator-activated receptor-γ coactivator 1β）、pdk4（pyruvate dehydrogenase kinase-4）等。

生物鐘基因?qū)趋兰∩砉δ艿恼{(diào)控作用包括肌肉生長和維持、收縮功能、結(jié)構(gòu)組織、葡萄糖代謝和能量生成[9]。利用整體或骨骼肌局部生物鐘基因缺陷技術(shù)構(gòu)建的小鼠模型為我們提供了遺傳學(xué)工具來研究生物鐘基因環(huán)路在骨骼肌中的功能機制。clock基因缺陷小鼠由于線粒體含量減少、線粒體活力下降以及非正常線粒體數(shù)量增加，表現(xiàn)出了骨骼肌肌力和運動耐力的下降，同時由于肌動蛋白、肌球蛋白和肌聯(lián)蛋白表達的減少造成了骨骼肌結(jié)構(gòu)的變化[10]。有研究表明，BMAL1 是骨骼肌增殖、分化、生肌祖細(xì)胞再生的正向調(diào)控因子。在bmal1基因缺陷小鼠模型中，除了一些晝夜節(jié)律行為和一些節(jié)律代謝活動的改變，還會出現(xiàn)骨骼肌纖維直徑的減小、肌纖維類型的轉(zhuǎn)變、肌節(jié)結(jié)構(gòu)的改變、骨骼肌對胰島素敏感性的降低；bmal1基因缺陷小鼠從8 周齡開始就已經(jīng)表現(xiàn)出骨骼肌重量的降低，同時肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力達到峰值，在40 周齡時基因缺陷小鼠不僅表現(xiàn)出壽命的降低，同時骨骼肌重量也出現(xiàn)降低，低至正常小鼠骨骼肌重量的一半[11]。rev-erbα基因缺陷的小鼠會影響骨骼肌細(xì)胞的分化，出現(xiàn)糖脂代謝平衡的紊亂，同時由于線粒體活性的下降和骨骼肌內(nèi)自噬反應(yīng)的增強導(dǎo)致小鼠骨骼肌運動能力減弱[12-14]。

2 生物鐘基因?qū)趋兰∩⌒纬傻恼{(diào)控

骨骼肌是胚胎發(fā)育過程中最早形成的組織之一，是由體節(jié)細(xì)胞經(jīng)過增殖、遷移、分化而形成。構(gòu)成骨骼肌的基本單位是肌纖維，肌纖維的類型、直徑、密度、肌節(jié)長度等都決定了骨骼肌的收縮力度、運動耐力等生理功能。生肌決定因子（myogenic determination gene，MyoD）在骨骼肌的生長發(fā)育過程中起到了決定作用[15]。生肌決定因子家族不僅與哺乳動物胚胎期肌細(xì)胞的增殖、分化、融合、肌纖維數(shù)量和體積的增大有關(guān)，還可以激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，將成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為骨骼肌細(xì)胞。MyoD 家族主要包括4 個成員，分別是生肌決定因子（MyoD）、肌細(xì)胞生成素（myogenin，MyoG）、生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）和生肌因子 6（Myf6）[16]。

生物鐘基因?qū)趋兰〗Y(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控機制之一是BMAL1/CLOCK 異二聚體作用于myod1啟動子區(qū)E 盒（E-box），從而介導(dǎo)了myod1的節(jié)律性振蕩表達。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，盡管MyoD1 在野生型小鼠骨骼肌中呈現(xiàn)振蕩表達，但這種振蕩表達在clock以及bmal1基因缺陷小鼠中均消失。然而，在clock和bmal1基因缺陷小鼠中雖然MyoD1 的振蕩表達受到影響，但表型上骨骼肌的生肌形成過程是正常的，這就說明存在某種相應(yīng)的補償機制，這種補償機制很可能是其他的生肌調(diào)節(jié)因子例如Myf5 發(fā)揮了補償作用[17-18]。在馬和斑馬魚的骨骼肌中，Myf6（Mrf4）的表達是隨著BMAL1 和CLOCK 表達時相的變化而變化的，這說明其他的生肌調(diào)節(jié)因子也可能直接受到生物鐘基因的調(diào)控,對骨骼肌生肌過程產(chǎn)生影響。

BMAL1/CLOCK 異二聚體除了直接調(diào)控MyoD1 的表達，也有報道發(fā)現(xiàn)BMAL1 通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Wnt 信號通路中的關(guān)鍵因子來調(diào)控成肌細(xì)胞的分化。事實上bmal1基因缺陷小鼠在受到例如凍傷等創(chuàng)傷后，出現(xiàn)骨骼肌再生缺陷和骨骼肌修復(fù)的減弱，肌衛(wèi)星細(xì)胞開始增殖分化，但肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，這其中部分是由于BMAL1 表達的抑制造成Wnt 信號通路中關(guān)鍵因子表達的抑制。在bmal1基因缺陷小鼠的成肌細(xì)胞中，通過激活Wnt 信號通路的表達活性可以部分恢復(fù)成肌細(xì)胞的分化。這說明在胚胎形成過程中，Wnt 信號通路對骨骼肌細(xì)胞分化起到了一定作用。

在成肌細(xì)胞分化過程中BMAL1 表達不斷增加，在成肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期并分化時BMAL1 的阻遏物REV-ERBα的表達就會受到抑制[19]。在小鼠C2C12 肌源性細(xì)胞系中，過表達REV-ERBα可以抑制成肌細(xì)胞的分化，MyoD1、MyoG 及肌節(jié)細(xì)胞中的α肌動蛋白的表達受到抑制。與此同時，RORα 結(jié)合與 REV-ERBα 相同的基因啟 動子序列，激活靶基因的表達[20]。因此，REV-ERBα 與RORα都在肌源性分化過程中發(fā)揮重要作用。

一旦細(xì)胞進入生肌形成過程，都會發(fā)生分化、融合并表達肌球蛋白等特異性功能蛋白。生物鐘基因?qū)Τ杉〖?xì)胞的融合以及對骨骼肌功能的影響報道較少。McCarthy 等已經(jīng)證明了編碼骨骼肌收縮基因的表達蛋白是具有晝夜節(jié)律的，其中某些基因編碼因子如肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白在clock基因缺陷小鼠中是明顯下調(diào)的[21]。鐘基因在骨骼肌纖維形成與轉(zhuǎn)化以及收縮功能的建立等方面的貢獻仍須深入研究。

3 生物鐘基因?qū)趋兰∧芰看x的調(diào)控

生物鐘基因可以調(diào)控機體內(nèi)的能量代謝過程，生物節(jié)律的紊亂往往對這一調(diào)控過程產(chǎn)生影響，造成機體內(nèi)能量代謝自穩(wěn)態(tài)的失衡，進而導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗等相應(yīng)癥狀的出現(xiàn)。在哺乳動物中，骨骼肌是糖脂代謝的主要器官，生物鐘對骨骼肌能量代謝的調(diào)控是機體能量代謝反應(yīng)的重要組成部分。生物鐘基因缺陷動物模型會出現(xiàn)骨骼肌能量代謝的紊亂。骨骼肌氧化分解碳水化合物和脂肪酸的過程也存在晝夜節(jié)律性，同時在培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)葡萄糖的攝取也存在晝夜節(jié)律[22]。bmal1和clock基因缺陷小鼠的葡萄糖和脂質(zhì)晝夜節(jié)律性變化消失。clock基因缺陷小鼠長期飼養(yǎng)后會出現(xiàn)肥胖、高血糖的表現(xiàn)[23]。此外，bmal1、per1/2雙缺陷小鼠和cry1/2雙缺陷小鼠會出現(xiàn)葡萄糖不耐癥[24-25]。

組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶Sirtuin-1（Sirt1）在培養(yǎng)的肌管細(xì)胞中可調(diào)節(jié)葡萄糖氧化和脂肪酸氧化反應(yīng)[26]。CLOCK∶BMAL1 異二聚體上調(diào)NAMPT的表達，NAMPT 可介導(dǎo)NAD+的合成并表現(xiàn)出節(jié)律性。由于NAD+是Sirt1 的重要輔助因子，因此NAD+介導(dǎo)了Sirt1 活性的晝夜節(jié)律變化[27]。Sirt1通過使BMAL1 去乙?；?，降低了CLOCK∶BMAL1異二聚體的轉(zhuǎn)錄活性，從而使其靶基因表達受抑。另外，Sirt1 可使PER2 去乙?；⒋龠M其降解[28]。因此，Sirt1 是將鐘基因與骨骼肌能量代謝聯(lián)系起來的一個關(guān)鍵因子。LKB1（肝激酶B1）在AMP/ATP 比增加時激活A(yù)MPK 能量代謝通路。AMPK 通過誘導(dǎo)Sirt1 的去乙?；D(zhuǎn)移酶活性介導(dǎo)PGC-1α（過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活劑1α）的去乙?；鳳GC-1α是調(diào)節(jié)骨骼肌中線粒體的合成與氧化呼吸的關(guān)鍵信號分子[29]。不同環(huán)境刺激（例如運動或禁食/進食）都可以通過調(diào)節(jié)骨骼肌中AMP/ATP 和NAD+/NADH 的比例分別控制AMPK 和Sirt1 的活性，進而通過靶向PGC-1α調(diào)節(jié)骨骼肌中的線粒體活性并對骨骼肌能量代謝產(chǎn)生影響[30]。

晝夜節(jié)律抑制性基因rev-erbα在骨骼肌的能量代謝過程中同樣發(fā)揮重要作用。在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)rev-erbα在氧化纖維中高表達并通過抑制線粒體自噬來促進骨骼肌的氧化能力[31]。作為配體依賴性核受體，REV-ERBα可受合成的配體調(diào)節(jié)，REV-ERBα的合成激動劑在小鼠中表現(xiàn)出抗肥胖和降脂功效。通過合成激動劑激活REV-ERBα可以誘導(dǎo)脂肪酸氧化，抑制骨骼肌中的脂質(zhì)合成基因，REV-ERBα可能在體內(nèi)起到降脂的重要作用[32]。研究表明REV-ERBα可以促進葡萄糖的優(yōu)先使用，減少脂質(zhì)的利用，rev-erbα基因缺陷小鼠表現(xiàn)出輕度高血糖癥和脂肪酸利用增加[12]。

4 結(jié)語

目前生物鐘基因?qū)趋兰≈猩⌒纬珊湍芰看x的調(diào)控已經(jīng)得到眾多研究者的認(rèn)同，但研究方向大都集中在BMAL1∶CLOCK 異二聚體的調(diào)控作用，對于骨骼肌中表達的其他生物鐘基因cry2、per2、rev-erbα和rorα以及相關(guān)鐘控基因dbp和tef1的研究相對較少?；谏镧娀?qū)ι⌒纬珊湍芰看x的研究，我們可以設(shè)想這些鐘基因及鐘控基因可以獨立抑或與BMAL1∶CLOCK 異二聚體共同發(fā)揮重要的調(diào)控作用，構(gòu)成生物鐘基因?qū)趋兰〉恼{(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時，機體的能量代謝也是在骨骼肌、肝臟、脂肪等產(chǎn)能器官相互協(xié)同作用下進行，我們是否可以找尋作為產(chǎn)能器官的外周生物鐘與SCN 中樞生物鐘之間的關(guān)系，建立起在生物鐘主導(dǎo)下的全身能量代謝網(wǎng)絡(luò)，從而更全面地分析生物鐘對機體能量代謝的調(diào)控。另一方面，人體長期處于睡眠剝奪狀態(tài)或睡眠時間不規(guī)律都會造成人體節(jié)律紊亂，引起生物鐘基因在骨骼肌中表達的改變，從而對骨骼肌生理運動功能以及能量代謝造成影響，進而降低人體作業(yè)能力。生物鐘基因調(diào)控的生肌調(diào)節(jié)因子和糖脂代謝的關(guān)鍵酶可以作為未來改善睡眠節(jié)律紊亂造成的作業(yè)能力下降的潛在作用靶點，相關(guān)干預(yù)藥物的研發(fā)具有十分重要的現(xiàn)實意義。