江 麗 余 輝 曹月霞 龔春燕

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病醫(yī)院藥劑科，江蘇南京 210042

蕁麻疹是由于皮膚、黏膜小血管擴張及滲透性增加出現(xiàn)的一種局限性水腫反應，臨床表現(xiàn)為大小不等的風團伴瘙癢，可伴有血管性水腫。其發(fā)病機制至今尚不十分清楚，可能涉及感染、變態(tài)反應、假變態(tài)反應和自身反應性等。目前，西醫(yī)治療蕁麻疹主要采用抗組胺藥物治療[1-2]，但是停藥后容易復發(fā)，遷延不愈。中醫(yī)藥治療蕁麻疹積累了豐富的經(jīng)驗，復方荊防顆粒是由中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院傳統(tǒng)中藥湯劑改變劑型制得，由防風、荊芥、蟬衣、黃芪、制首烏、白鮮皮、地膚子等13 味中藥組成，針對蕁麻疹的外感風邪，脾肺氣虛，應用祛風止癢、清熱和胃、補脾益肺進行辨證施治[3-5]。通過多年的臨床觀察，復方荊防顆粒在治療蕁麻疹中有利于控制病情發(fā)展，顯著提高臨床效果。為了有效對其質(zhì)量進行控制，本研究利用固相萃取-超高效液相色譜法（SPE-UPLC）快速同時測定君藥防風中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，能夠明顯地減少雜質(zhì)干擾，具有快速、簡便、準確度高和重復性好等優(yōu)點，對復方荊防顆粒的質(zhì)量控制有重要的指導意義。

1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（UPLC）、TUV 檢測器、Empower2 軟件（Waters 公司）；十萬分之一電子分析天平（AE240，梅特勒爾-托利多公司）；水浴鍋（HH-4 型，常州國華電器有限公司）；Milli-Q Synergy system 超純水系統(tǒng)（Millipore 公司）；中性氧化鋁小柱（2 g/6 mL，Supelclean SPE，SIGMA 公司）；聚酰胺小柱（500 mg/6 mL，Discovery SPE，SIGMA 公司）；升麻素苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111522-201702，含量為96.2%）；5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111523-201610，含量為96.1%）；復方荊防顆粒（中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院自制制劑，委托南京中山制藥有限公司加工，批號：20180701、20180702、20180703）；乙腈為德國默克公司色譜純試劑；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性實驗

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相為水-乙腈，梯度洗脫；檢測波長254 nm[6]；流速：0.4 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。理論板數(shù)以升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰計算應不低于3000。

表1 梯度洗脫順序

2.2 溶液的制備

對照品溶液制備：精密稱取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，置于同一50 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取5 mL 至50 mL 容量瓶中，用20%乙腈稀釋至刻度，搖勻。制成每毫升約含升麻素苷20 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷20 μg 的對照品溶液。

供試品溶液制備：取10 袋復方荊防顆粒，混勻，取適量，研細，取約9 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇100 mL，稱定重量，85℃水浴回流提取1.0 h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液10 mL 加入中性氧化鋁小柱，用25%乙醇25 mL 洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加2 mL 水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，即得。用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

陰性樣品溶液制備：按處方制備不含防風的陰性制劑，并按上述供試品溶液制備方法操作，制得陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

精密吸取上述對照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件進樣測定，結果供試品色譜與對照品色譜在相應保留時間處有同一色譜峰，而陰性樣品溶液無峰，提示無陰性干擾成分。見圖1。

2.4 線性關系考察

精密稱定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，置于同一100 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。制成每mL 約含升麻素苷0.5 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.5 mg 的對照品溶液。分別精密吸取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶 液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL至50mL容量瓶中，以20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，得濃度為5、10、20、40、60、80 mg/L 標準曲線溶液。按上述液相色譜條件分析，測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積，并以峰面積（A）對濃度C（mg/L）進行線性回歸。升麻素苷回歸方程為：A ＝40195C-248.67，r=1.0000；結果表明升麻素苷在5～80 mg/L 范圍內(nèi)峰面積與濃度范圍內(nèi)線性良好。5-O-甲基維斯阿米醇苷回歸方程為：A ＝42577C+12782，r=1.0000；結果表明5-O-甲基維斯阿米醇苷在5～80 mg/L 范圍內(nèi)峰面積與濃度線性良好。

2.5 精密度試驗

取“2.2”項下制備的對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣5 次，進行色譜分析，測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，RSD 分別為0.21%、0.62%（n=5）。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取復方制劑同一批號樣品約9.0 g（批號：20180701），精密稱定，按“2.2”項下制備方法處理，得樣品溶液，分別于0、2、4、8、12 h 測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，RSD 分別為1.27%、0.56%（n=5），結果表明樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

圖1 復方荊防顆粒的超高效液相色譜圖

取同一批號的復方制劑約9.0 g（批號：20180701），精密稱定，按“2.2”項下制備方法處理，得樣品溶液。平行操作6 次，進行樣品分析，測定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的峰面積，以外標法計算含量。6 份供試品溶液所測得升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均含量分別為79.67、126.64 μg/袋，RSD 分別為1.02%、1.61%（n=6），表明該法重現(xiàn)性較好。

2.8 加樣回收率試驗

對照品儲備液：精密稱取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，置于同一10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。制成每mL 中約含升麻素苷0.942 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷1.048 mg 的對照品溶液。

取10 袋復方荊防顆粒，混勻，取適量，研細，取約9 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇100 mL，精密加入升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品儲備液1 mL，稱定重量，85℃水浴回流提取1.0 h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液10 mL 加入中性氧化鋁柱，用25%乙醇25 mL 洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加2 mL 水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液備用。各平行操作6 次。另稱取復方制劑9.0 g，精密稱定，同上述樣品溶液制備，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液進樣測定。見表2。

表2 加樣回收率結果（n=6）

2.9 樣品測定

取3 批復方荊防顆粒（批號：20180701、20180701、20180701）按照“2.2”項下制備方法分別制備成樣品溶液，并按上述色譜條件測定3 批樣品。見表3。

3 討論

3.1 指標成分的選擇

中藥復方制劑所含化學成分數(shù)目眾多，這也是發(fā)揮多方面功效的重要物質(zhì)基礎。本實驗復方荊防顆粒處方由13 味中藥組成，所含成分復雜，其中防風為處方中的君藥。2015 版《中華人民共和國藥典》一部[6]收載的防風藥材飲片質(zhì)量標準中對升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷進行了含量測定，故本實驗經(jīng)考察選擇升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷作為定量指標。

表3 樣品含量測定結果（n=3）

3.2 色譜條件優(yōu)化

實驗中比較了不同組成的流動相[7-17]，水-乙腈、水-甲醇、0.05%甲酸－甲醇、0.05%甲酸－乙腈4 種系統(tǒng)，結果表明，選用乙腈和水溶液為流動相梯度洗脫，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的分離度、保留時間和色譜峰形均較好。

3.3 提取條件優(yōu)化

對升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的回流提取條件進行了考察[18-22]，在提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇和無水甲醇）和提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 h）條件下考察其提取得率，并對回流提取與超聲提取進行比較，最終選擇了75%甲醇85℃水浴回流提取1 h。

由于本品為復方制劑，樣品中成分較多，為減少測定中其他成分的干擾，降低樣品對色譜柱的污染，制備樣品溶液時采用SPE 小柱處理樣品[23-24]。分別采用聚酰胺小柱（500 mg/6 mL）和中性氧化鋁小柱（2 g/6 mL），用水洗脫。結果發(fā)現(xiàn)在聚酰胺柱上對君藥防風兩組分有一定的吸附，故采用中性氧化鋁小柱。

本實驗對SPE 洗脫條件進行了優(yōu)化。首先，比較了水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和無水乙醇去除極性大的有機雜質(zhì)的效果，發(fā)現(xiàn)25%乙醇除雜效果好且洗脫液中兩組分含量高。其實，考察洗脫溶劑體積（15、20、25、30 mL），發(fā)現(xiàn)25 mL 溶劑即可將兩組分完全洗脫下來，故選擇洗脫溶劑體積為25 mL。

3.4 UPLC 的優(yōu)勢

與HPLC 比較，UPLC 具備更高的分離度和靈敏度，同時可大大節(jié)省分析時間和溶劑用量，尤其適用于中藥制劑的質(zhì)量分析。本實驗利用UPLC 的優(yōu)勢，10 min 便可完成對復方荊防顆粒中君藥防風兩種成分的同時測定。該方法簡單高效，經(jīng)濟實用，精密度、穩(wěn)定性、重復性、回收率均較好，可作為復方荊防顆粒的質(zhì)量控制方法。