余 靜 朱應(yīng)成 祁 俊 梁朝鋒 徐 斌

安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖 241000

川歸補(bǔ)腎通絡(luò)方（丹參、炮山甲、龜甲、龍血竭、當(dāng)歸、川芎、地龍、土鱉蟲、鹿茸、人中黃、淫羊藿、肉桂、三七、冰片、海星），具有補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)、強(qiáng)筋健骨、行氣止痛之功效，臨床應(yīng)用于血瘀、肝腎虧虛型股骨頭缺血性壞死，癥見(jiàn)疼痛、活動(dòng)不利、骨不愈合等。

本課題組已在前期研究中建立了川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]，并運(yùn)用現(xiàn)代中藥制藥技術(shù)將其制備成適合大生產(chǎn)的川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊。但由于中藥復(fù)方制劑的藥味較多，具有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，各成分有其獨(dú)特的藥理活性，因此中藥制劑的療效亦是方中眾多共存活性成分相互作用的結(jié)果，若僅采用單一指標(biāo)成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，恐難以全面把控中藥復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量、臨床療效。因此，本研究選取本方的代表藥材丹參中的兩個(gè)主要活性成分丹酚酸B 和丹參酮ⅡA[2-6]，作為川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定其含量的方法，共同監(jiān)控本制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters e2695 型高效液相色譜儀[含二極管陣列檢測(cè)器（PDA），美國(guó)沃特世公司]；萬(wàn)分之一電子天平（XP-205、AL-204，梅特勒-托利多儀器有限公司）。

川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊（安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院自制，規(guī)格：0.3 g/粒，批號(hào)：180801、180802、180803）；丹酚酸B 對(duì)照品、丹參酮ⅡA 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)分別為：111562-201212、110766-2010619，純度分別為95.4%、100%）；甲醇、乙腈和磷酸為色譜純；水（“娃哈哈”純凈水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)；流動(dòng)相A 為乙腈（A）、B 為0.1%磷酸溶液，二元梯度洗脫：0～16 min A：24%，17～32 min A：75%，33～35 min A：24%；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm（丹參酮ⅡA）、286 nm（丹酚酸B）；柱溫為20℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取丹酚酸B 46.99 mg 至50 mL 量瓶中，丹參酮ⅡA 對(duì)照品19.20 mg至200 mL 量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為896.6、96 μg/mL 的丹酚酸B 對(duì)照品儲(chǔ)備液、丹參酮ⅡA 對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取丹酚酸B對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL 及丹參酮ⅡA 對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL 共同加入至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到丹酚酸B 及丹參酮ⅡA 濃度分別為448.3、9.6 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，冷藏保存，使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率350 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱重，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例稱取缺丹參的其余藥材，按本制劑的制備工藝制成缺丹參的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性空白溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。供試品色譜中，在與各對(duì)照品色譜峰相應(yīng)保留時(shí)間處有吸收峰，各待測(cè)成分與相鄰色譜峰分離度均＞1.5，而陰性樣品溶液中未見(jiàn)相應(yīng)待測(cè)成分色譜峰。見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系的考察

圖1 川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊HPLC 色譜圖

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL 至2 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果丹酚酸B 的回歸方程為Y=12 650X-1973.3（r=0.9996）、丹參酮ⅡA 的回歸方程為Y=54 274X+22 206，（r=0.997）。結(jié)果表明，丹酚酸B 進(jìn)樣濃度在44.83～448.30 μg/mL 范圍內(nèi)，丹參酮ⅡA 進(jìn)樣濃度在0.96～9.60 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液（丹酚酸B 44.83 μg/mL、丹參酮ⅡA 49 μg/mL），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，結(jié)果丹酚酸B、丹參酮ⅡA 的峰面積RSD 均為0.4%，表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液（丹酚酸B 44.83 μg/mL、丹參酮ⅡA 49.0 μg/mL），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于1、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果丹酚酸B、丹參酮ⅡA 峰面積RSD 分別為1.3%、1.5%，表明在24 h 內(nèi)各化合物穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：180801）共6 份，每份約1 g，精密稱定，分別置于6 個(gè)50 mL 置具塞錐形瓶中，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算丹酚酸B、丹參酮ⅡA 的含量分別為7.65 mg/g、211.77 μg/g，RSD 分別為1.1%、0.7%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：180801）共6 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于6 個(gè)50 mL 量瓶中，分別精密加入丹酚酸B 對(duì)照品儲(chǔ)備液、丹參酮ⅡA 對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加70%甲醇至刻度，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。丹酚酸B、丹參酮ⅡA的平均加樣回收率分別為99.7%、97.4%，RSD 分別為1.9%、1.7%。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取3 批川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：180801、180802、180803）約1 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算丹酚酸B、丹參酮ⅡA 的含量。見(jiàn)表2。

表2 3 批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇

川歸補(bǔ)腎通絡(luò)方中丹參具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、生津養(yǎng)血、行滯通痹的功效，可用于治療氣虛乏力、中氣下陷、血虛萎黃、半身不遂、痹痛麻木等癥[7]。主要化學(xué)成分有丹參酮、丹參酚酸類、揮發(fā)油及無(wú)機(jī)元素等，其中以水溶性成分丹酚酸B 和脂溶性成分丹參酮ⅡA 最具有代表性，發(fā)揮抗炎、抗血栓、改善血液循環(huán)[5]，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖等藥理作用[8-12]，是川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊治療股骨頸骨折術(shù)后股骨頭缺血性壞死的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本研究選擇丹酚酸B、丹參酮ⅡA 作為川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本研究利用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 進(jìn)行光譜掃描，得到2 個(gè)待測(cè)組分在210～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收?qǐng)D譜，確定各成分的最大吸收波長(zhǎng)，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]，采用雙波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定，保證2 個(gè)待測(cè)成分均在最大吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高、干擾小，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為270 nm（丹參酮ⅡA）、286 nm（丹酚酸B）。

3.3 流動(dòng)相的選擇

已有文獻(xiàn)報(bào)道高效液相色譜法定量測(cè)定含丹參中藥制劑中的丹酚酸B 和丹參酮ⅡA，常采用乙腈-磷酸水[15-17]、乙腈-甲酸水[18-19]、甲醇-磷酸水[20]等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行洗脫。本研究考察了乙腈、甲醇、磷酸、水等多個(gè)不同組合，經(jīng)過(guò)對(duì)比選取乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相，并優(yōu)化梯度洗脫條件，在一個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)下實(shí)現(xiàn)丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的良好分離，且峰形對(duì)稱，與相鄰色譜峰未見(jiàn)干擾[21-24]。

3.4 樣品提取工藝的選擇

本研究以丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，單因素考察了川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊的提取方式（超聲、回流）、提取時(shí)間（0.5、1 h）、提取溶劑（70%甲醇、90%甲醇），確定川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊的最佳提取工藝為加70%甲醇50 mL 超聲處理30 min[21]。該樣品前處理?xiàng)l件簡(jiǎn)便，可有效避免因前處理過(guò)程繁瑣而造成的含量測(cè)定結(jié)果誤差。

3.5 實(shí)驗(yàn)溫度條件的選擇

丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 在高溫及日光下易降解，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照品及樣品溶液應(yīng)避光冷藏保存，并參考2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》將柱溫設(shè)置為20℃[7]。

4 結(jié)論

本研究首次建立高效液相色譜法同時(shí)定量測(cè)定川歸補(bǔ)腎通絡(luò)膠囊中丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的方法，經(jīng)驗(yàn)證所建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，對(duì)多種處方中含丹參的中藥制劑的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持和有益參考。