朱 騫 張 玲 袁 鵬 李 郁 張 濰 楊 紅

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院婦科，陜西西安 710032；2.西北婦女兒童醫(yī)院婦一科，陜西西安 71006；3.西北婦女兒童醫(yī)院婦科內(nèi)分泌科，陜西西安 710061；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)生化教研室，陜西西安 710032

宮頸癌是女性第二大惡性生殖系統(tǒng)腫瘤，致死率位居世界第四[1]，晚期患者預(yù)后1 年存活率僅為10%-20%[2]?；熓悄壳皩m頸癌患者術(shù)后延長生命的主要輔助治療方式，順鉑（Cisplatin，DDP）是常見化療藥，但其耐藥性的出現(xiàn)使得宮頸癌的治療效果并不理想[3-5]。LncRNA CDKN1A 反義鏈啟動子DNA 損傷激動RNA（promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA，PANDAR）近年來被證實與多種腫瘤的進展及預(yù)后相關(guān)，已成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點分子。研究發(fā)現(xiàn)，PANDAR 高表達(dá)可促進結(jié)直腸癌生長及轉(zhuǎn)移[6]，還可作為我國癌癥患者預(yù)后不良指標(biāo)[7]。此外，PANDAR 與胃癌TNM 分級、腫瘤轉(zhuǎn)移、化療耐受息息相關(guān)[8]。但是，其在宮頸癌化療耐受中的作用尚不明確。本研究擬構(gòu)建宮頸癌耐受細(xì)胞HeLa-DDP，分析PANDAR 對宮頸癌親本細(xì)胞及耐受細(xì)胞順鉑敏感性的影響，從而為宮頸癌的化療耐受提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人宮頸癌HeLa 細(xì)胞購自上海拜力公司；順鉑購自Sigma 公司（批號：1763258）；CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司（批號：C0038）；Annexin VFITC/PI 凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：20180415）；一鏈cDNA 合成試劑盒購自Invitrogen 公司（批號：00743856）；實時熒光定量試劑盒購自寶生物工程大連有限公司（批號：11756）；LV-sh-PANDAR 慢病毒載體購自和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

將人HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液中，每2～3 天換一次液，所有細(xì)胞放置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 耐藥細(xì)胞株HeLa-DDP 的建立

取對數(shù)生長期HeLa 細(xì)胞接種于含0.1 μg/mL 順鉑的RPM1640 培養(yǎng)液中，每隔24 h 洗去死亡細(xì)胞，更換新的含順鉑培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，以細(xì)胞形態(tài)與親本無明顯差異且培養(yǎng)液澄清確定該代細(xì)胞誘導(dǎo)成功。待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后，每10 代根據(jù)細(xì)胞最低致死劑量逐漸增加順鉑濃度，如此反復(fù)換液傳代，間歇誘導(dǎo)6 個月最終篩選出順鉑耐受的細(xì)胞，命名為HeLa-DDP。將細(xì)胞接種于96 孔板中，加入0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL 順鉑孵育，48 h 后檢測細(xì)胞活性，評估耐受細(xì)胞株是否構(gòu)建成功。

1.4 PANDAR 過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

將PANDAR 全長序列克隆至pEGFP-C1 載體上構(gòu)建重組的pEGFP-C1-PANDAR 質(zhì)粒；將HeLa-DDP細(xì)胞接種于6 孔板中，分別加入1 μg 的pEGFP-C1-PANDAR 質(zhì)粒或者pEGFP-C1 載體，同時加入XtremeGENETMHP DNA 轉(zhuǎn)染試劑孵育；37℃過夜孵育，將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，48 h 后收集樣品，qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率。設(shè)置對照組（未處理組）、vector 組、PANDAR 處理組。

1.5 LV-sh-PANDAR 的感染

將親本HeLa 細(xì)胞及HeLa-DDP 耐受細(xì)胞接種于6 孔板中，加入重組慢病毒載體LV-sh-PANDAR 及陰性對照LV-sh-NC，48 h 后收集細(xì)胞，qRT-PCR 檢測PANDAR 表達(dá)水平。設(shè)置對照組、sh-NC 陰性組及sh-PANDAR 組。

1.6 qRT-PCR 檢測PANDAR 水平

TRIzol 抽提細(xì)胞總RNA 以合成cDNA，以其為模板進行real-time PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：0.8 μL 特異性擴增引物、10 μL SYBRTMPremix EX TaqTMⅡ、0.4 μL 的ROX Reference Dye Ⅱ，加ddH2O 補充至20 μL。PANDAR 特異性擴增引物如下：上游5′-GAGGATGACCTTCGGGTTAAAT-3′；下游5′-TAGAGCCAGGAACAGGAAGA-3′。PCR 反應(yīng)程序如下：95℃30 s，循環(huán)1 次；95℃5 s，60℃30 s，循環(huán)40 次。所有反應(yīng)在ABI PRISM 7900 熒光定量PCR 儀上進行。

1.7 CCK-8 檢測細(xì)胞活性

將HeLa 及HeLa-DDP 細(xì)胞接種于96 孔板中，其中HeLa 細(xì)胞用1、2、4、8 μg/mL順鉑處理，而HeLa-DDP 細(xì)胞用1、2、4、8、16 μg/mL 順鉑處理；48 h后加入10 μL CCK-8 溶液孵育4 h，酶標(biāo)儀上檢測OD450吸光光度值，每孔重復(fù)3 次。

1.8 流式檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞，加入500 μL 結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 及PI，室溫下避光孵育，10 min后加樣品置流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡。設(shè)置對照組（Control 組）、Cisplatin 組、Cisplatin+vector 組、Cisplatin+PANDAR 組。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用ANOVA 方差分析及SNK-q 檢驗，兩組間比較采用t 檢驗，以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建順鉑耐受的HeLa-DDP 細(xì)胞

與親本HeLa 細(xì)胞比較，Cisplatin 作用下HeLa-DDP 耐受細(xì)胞存活率較高，IC50為6.2 μg/mL，而HeLa IC50為0.6 μg/mL，見圖1A。用1.56 μg/mL 的Cisplatin處理后，親本HeLa 細(xì)胞凋亡率較耐受細(xì)胞更高（P <0.05），見圖1B。

圖1 順鉑耐受的HeLa-DDP 細(xì)胞的構(gòu)建

2.2 lncRNA PANDAR 在HeLa-DDP 宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

與親本HeLa 細(xì)胞比較，HeLa-DDP 細(xì)胞中PANDAR 表達(dá)水平明顯降低（P <0.05）。見圖2。

圖2 PANDAR 在HeLa-DDP 及親本細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.3 PANDAR 過表達(dá)對HeLa-DDP 細(xì)胞順鉑耐受的影響

PANDAR 處理后細(xì)胞中PANDAR 的表達(dá)顯著性上調(diào)（P <0.05），見圖3A；其過表達(dá)顯著性下調(diào)Cisplatin 處理組中HeLa-DDP 細(xì)胞存活率（P <0.05），見圖3B；同時加強Cisplatin 處理組細(xì)胞凋亡（P <0.05），見圖3C。

2.4 PANDAR 沉默對HeLa-DDP 細(xì)胞順鉑耐受的影響

sh-PANDAR 處理顯著性降低細(xì)胞中PANDAR的表達(dá)水平（P <0.05），見圖4A；PANDAR 沉默可上調(diào)Cisplatin 作用下細(xì)胞的存活率（P <0.05），見圖4B。

2.5 PANDAR 沉默對HeLa 細(xì)胞順鉑敏感性的影響

與control 組比較，sh-PANDAR 組HeLa 細(xì)胞中PANDAR 的表達(dá)水平顯著降低（P <0.05），見圖5A；PANDAR 沉默增加Cisplatin 處理下細(xì)胞的存活率（P <0.05），見圖5B。

3 討論

順鉑是目前臨床上治療宮頸癌等比較常見的一線化療藥，但其耐藥性的出現(xiàn)導(dǎo)致患者治療失敗[4，9]。本研究成功構(gòu)建順鉑耐受的宮頸癌細(xì)胞，這將為進一步探討宮頸癌耐藥性的防治奠定基礎(chǔ)。

lncRNA 可通過調(diào)控miRNA 等影響癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移等[10-14]。順鉑是一種廣譜化療藥，可通過干擾DNA 修復(fù)進程造成DNA 損傷從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。lncRNA PANDAR 可被p53 調(diào)控以應(yīng)對DNA 損傷，近期證實可作為腫瘤預(yù)后標(biāo)記分子[16]，且其表達(dá)與胃癌TNM 分級、化療耐受密切相關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，PANDAR 在宮頸癌順鉑耐受細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，提示其可能參與宮頸癌細(xì)胞化療耐受。

已知PANDAR 在多種癌癥中異常高表達(dá)，與患者預(yù)后不良息息相關(guān)[17-19]。Rivandi 等[20]發(fā)現(xiàn)PANDAR在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，可調(diào)控細(xì)胞增殖及腫瘤生長[16]。此外，PANDAR 上調(diào)促進膀胱癌惡性進程。近期研究證實PANDAR 在卵巢癌耐受組織及細(xì)胞中高表達(dá)，其沉默增加癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[21]。與該研究不同，本研究發(fā)現(xiàn)PANDAR 沉默增加HeLa-DDP 對順鉑的耐受性，同時降低HeLa 細(xì)胞對順鉑的敏感性。

圖3 PANDAR 過表達(dá)對HeLa-DDP 細(xì)胞順鉑耐受的影響

圖4 PANDAR 沉默對HeLa-DDP 細(xì)胞順鉑耐受的影響

圖5 PANDAR 沉默對HeLa 細(xì)胞順鉑敏感性的影響

綜上所述，本研究證實，PANDAR 沉默可降低宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性及HeLa-DDP 對順鉑耐受性，這將為宮頸癌化療耐受提供新的治療策略。