王煜鵬，楊揚，王學軍，周喆，王升啟

1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2.軍事醫(yī)學研究院 輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

肝臟作為中樞代謝協(xié)調(diào)器，具有廣泛的基本功能，包括葡萄糖和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)合成和膽汁合成。此外，當肝臟受到損傷后，具有一定程度的自我更新和修復能力。近幾十年來，肝臟疾病一直是全世界最為關注的人類健康問題之一，研究發(fā)現(xiàn)在全球范圍內(nèi)肝臟疾病的發(fā)生率和死亡率均呈顯著上升趨勢[1]。近年來盡管人類在肝病治療領域取得了較大進展，但因其全球患病率高、長期臨床療效差、致病因素多且臨床上常同時出現(xiàn)多種表型，所以目前在提高肝病患者治愈率及生存率方面仍然收效甚微[2]。因此，迫切需要提高對各種肝病復雜性的認識，以幫助獲得更準確的疾病亞型，用于個性化治療。

細胞是人體中最小的結構和功能單元，每個功能單元都有不同的來源和背景，它不僅存在于不同生物體中，而且存在于同一個生物體的不同器官和組織中[3-4]。肝臟中的細胞種類較為豐富，包括肝細胞、肝內(nèi)皮細胞、星狀細胞、膽管細胞以及各種免疫細胞。在肝炎、肝纖維化或肝癌等肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，即使同一類細胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學等都會發(fā)生變化甚至會分化產(chǎn)生新的細胞亞型，導致疾病的進一步惡化和轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)的研究技術和方法往往要從大量細胞中提取DNA、RNA或蛋白質(zhì)，得到的是這些細胞的整體表征，很多重要的低豐度細胞的顯著差異信息會被丟失，這可能會直接影響病情的正確評估和治療方案的正確選擇。

單細胞測序技術作為一項新興技術，一經(jīng)推出就受到廣泛關注，并在過去幾年得到迅速發(fā)展。它可以彌補傳統(tǒng)研究技術和方法的不足，在單細胞分辨率水平展示肝臟的全面視圖，概述肝臟中駐留細胞的特征，特別是提供肝臟免疫微環(huán)境的圖譜，在理解肝臟細胞發(fā)育軌跡、表征組織內(nèi)細胞異質(zhì)性、分析基因表達差異方面展現(xiàn)出了前所未有的優(yōu)勢。單細胞測序技術的蓬勃發(fā)展為生物學、醫(yī)學、癌癥學等研究領域帶來了一場空前革命，為眾多可能性打開了大門[5-8]。本文將主要闡述單細胞測序及其在肝臟疾病研究中的應用。

1 單細胞測序方法分類

單細胞測序技術發(fā)展至今得到了廣泛的拓展和研究，下面對當前已有的單細胞測序方法進行簡要綜述。

1.1 單細胞基因組測序

單細胞DNA測序（scDNA-seq）作為在單細胞水平上對細胞全基因組進行擴增和測序的一項技術，需要對分離出的單細胞微量基因組進行全基因組擴增（whole genome amplification，WGA）。為了確保無偏倚的高基因組覆蓋率，自單細胞測序技術誕生后近20年來，WGA技術發(fā)生了幾次重大變革。WGA主要有3種方式，即簡并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應（degenerate oligonucleotide primer polymerase chain reaction，DOP-PCR）[9]、多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）[10]和基于多個退火和循環(huán)的擴增循環(huán)（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）[11]。盡管 WGA 可以提高 scDNA-seq的敏感性，但單細胞DNA研究主要聚焦拷貝數(shù)變異（CNV），因為準確鑒定CNV要求相當高的敏感性，所以目前仍然是個挑戰(zhàn)。

1.2 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序通常稱為單細胞RNA測序（scRNA-seq），用于解析復雜生物系統(tǒng)中單細胞水平的細胞類型差異和基因表達譜，在定義新的細胞類型、發(fā)現(xiàn)新的生物標志物以及分析和理解細胞異質(zhì)性方面有著獨特的優(yōu)勢。單細胞RNA測序比單細胞DNA測序更容易實施，因為每個細胞都包含許多RNA分子，但DNA分子拷貝數(shù)卻極少[12]。進行常規(guī)基因表達分析時，一般選擇基因的3'端測序，而當進行免疫克隆以及T細胞受體（TCR）和B細胞受體（BCR）相關研究時，則應選擇5'端測序。5'端測序會進行V（D）J全長片段的組裝和注釋，對單個T細胞TCR的α和β鏈序列進行匹配，以及對單個B細胞的BCR輕鏈和重鏈序列的匹配，這對于探索適應性免疫系統(tǒng)具有重要意義。

1.3 單細胞DNA甲基化測序

在正常細胞發(fā)育過程中，DNA甲基化是許多物種中重要的表觀遺傳標記，它作為化學或蛋白質(zhì)標簽存在于DNA序列中。這種標簽在不改變現(xiàn)有DNA序列的基礎上，時刻記錄著細胞的發(fā)育變化過程，參與決定生物學調(diào)控過程的開啟或關閉，控制細胞的命運。之前對于DNA甲基化的研究是建立在大量細胞的整體測量上，這掩蓋了細胞之間的差異以及一些稀有細胞類型的影響。因此，在單個細胞中測量DNA甲基化的能力可能對理解幾個關鍵的生物學過程（例如胚胎發(fā)育、疾病進展和衰老）做出重要貢獻[13]。

1.4 單細胞組蛋白修飾測序

組蛋白修飾可調(diào)節(jié)某些特定DNA區(qū)域的親和力和可及性。為了解析組蛋白修飾在不同細胞中的作用，先后開發(fā)了單細胞染色質(zhì)免疫沉淀測序（single-cell chromatin immunoprecipitation sequencing，scChIP-seq）[14]、測序后單細胞染色質(zhì)整合標記（single-cell chromatin integration labeling followed by sequencing，scChIL-seq）[15]、靶向性和標簽化的單細胞裂解（single-cell cleavage undertargets and tagmentation，scCUT＆Tag）[16]以及單細胞染色質(zhì)免疫切割然后測序（single-cell chromatinimmune-cleavage followed by sequencing，sc-ChIC-seq）[17]等4種方法。這些先進的單細胞技術可以在一些不能僅通過轉(zhuǎn)錄組來分析細胞的情況下，揭示表觀遺傳異質(zhì)性的各個方面，有望在癌癥基因組學和相關轉(zhuǎn)化研究中得到更多應用。

1.5 單細胞染色質(zhì)結構測序

染色質(zhì)結構在胚胎發(fā)育、分化及疾病發(fā)展中起核心作用。對轉(zhuǎn)座酶核可及的染色質(zhì)進行單細胞測序（single-cell sequencing for transposase accessible chromatin，scATAC-seq），即是以在功能上鑒定細胞中染色質(zhì)結構的相關變化為目的的一項解決方案。使用scATAC-seq，讓研究者能夠通過識別每個細胞中開放染色質(zhì)位點的基因組位置的變異性，從而洞悉由其他相同的DNA序列產(chǎn)生的細胞間變異性，觀察染色質(zhì)致密化和DNA結合蛋白如何精準調(diào)節(jié)基因表達，達到補充單細胞DNA和RNA測序獲得的DNA拷貝數(shù)變異和RNA表達數(shù)據(jù)的目的，在功能上鑒定癌細胞特定亞群中染色質(zhì)結構的相關變化是其獨特優(yōu)勢[18]。

1.6 單細胞空間轉(zhuǎn)錄組測序

在單細胞測序技術發(fā)展日益成熟的環(huán)境下，基于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的單細胞空間轉(zhuǎn)錄組測序技術應運而生。它將Visium空間內(nèi)視技術與單細胞轉(zhuǎn)錄組測序相結合，產(chǎn)生了Visium Spatial基因表達解決方案。使用這一方案，可測量組織切片中的總mRNA，并且只需要帶有完整組織切片的Visium Spatial玻片作為輸入，將細胞中基因的表達無偏離地對應在組織切片上，為我們提供以前無法獲得的組織生物學觀點。但為了保證mRNA轉(zhuǎn)錄本的完整性以及保持組織切片的形態(tài)質(zhì)量，正確的組織處理和制備技術對于此方案極為重要。這一方法的出現(xiàn)，使以往難以解離的組織，以及一些數(shù)量稀少且極易發(fā)生應激死亡的細胞類型，有了以單細胞水平探索轉(zhuǎn)錄組的可能。

2 單細胞測序在肝臟生理功能研究中的應用

肝臟作為代謝和免疫反應發(fā)生的主要場所之一，是人體中體積最大的器官。然而，關于組成肝臟及其免疫微環(huán)境的細胞知之甚少。因此，以單細胞分辨率展示肝臟的全面視圖，概述肝臟中駐留細胞的特征，特別是提供肝臟免疫微環(huán)境的細胞圖譜，對于了解肝病的發(fā)病機理和治療至關重要。2017年，Halpern等[19]利用單分子熒光原位雜交（single molecule fluorescencein situhybridization，smFISH）與單細胞RNA測序技術相結合，首次對小鼠的整個肝臟單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜進行了研究，這使人們更充分地意識到肝臟中細胞的高度異質(zhì)性以及區(qū)域特性，在細胞層面上對健康肝臟組織生理加深了理解。之后，MacParland等[20]通過對5個人類新鮮肝組織的分離獲得的8444個實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄譜進行單細胞RNA測序，揭示了不同的肝內(nèi)巨噬細胞群體，即存在2種不同的肝內(nèi)CD68+巨噬細胞種群，分別具有促進炎癥和免疫調(diào)節(jié)功能。這為更精確地了解肝內(nèi)巨噬細胞亞群在肝病發(fā)生和發(fā)展中的作用以及開發(fā)新的免疫調(diào)節(jié)療法提供了參考。隨后，在肝臟的細胞組成仍然知之甚少的情況下，Aizarani等[21]對來自9位人類供體正常肝臟中的細胞進行了單細胞RNA測序，以構建人類肝臟細胞圖集。通過分析確定了內(nèi)皮細胞、枯否細胞和肝細胞先前未知的亞型，揭示了肝細胞和內(nèi)皮細胞在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的區(qū)域劃分，并發(fā)現(xiàn)不同類型的肝細胞可能協(xié)同執(zhí)行基本功能。這份人類肝臟細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜為發(fā)現(xiàn)正常和患病的肝臟中以前未知的細胞類型提供了強大的數(shù)據(jù)支持。針對目前的研究現(xiàn)狀，Halpern等[22]在普通單細胞測序基礎上開發(fā)了配對細胞RNA測序（paired cell RNA sequencing，pcRNAseq），分析肝細胞及相鄰肝內(nèi)皮細胞的基因表達，并利用肝細胞標記基因確定其在組織中的定位，以高空間分辨率解決了肝內(nèi)皮細胞基因的空間分區(qū)模式。同時，Gravina等[23]采用單細胞DNA甲基化組學分析，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟內(nèi)全基因組5-甲基胞嘧啶（5mC）模式具有高度異質(zhì)性，DNA甲基化模式中的表觀突變頻率比體細胞突變頻率高至少2個數(shù)量級。

在對成熟肝臟的生理有了一定了解之后，以單細胞分辨率探究肝臟的發(fā)育過程也逐漸取得成果。Su等[24]采用無標記scRNA-seq技術分析了小鼠肝臟發(fā)育過程中從胚胎11.5 d到出生后2.5 d的7個時期中隨機選擇的507個細胞和出生后3.25 d小鼠肝臟中52個Epcam陽性的膽管細胞的綜合轉(zhuǎn)錄譜，揭示了小鼠肝臟發(fā)育的動態(tài)軌跡，并且發(fā)現(xiàn)細胞間的異質(zhì)性存在于肝臟發(fā)育的各個階段和病理狀態(tài)。同樣針對肝臟發(fā)育，Segal等[25]利用scRNA-seq技術，以單細胞分辨率探索人類胎兒和成年肝臟的轉(zhuǎn)錄組，在人類胎兒肝臟中發(fā)現(xiàn)了肝膽雙能祖細胞（HHyP）的存在，這為胚胎發(fā)育、體內(nèi)平衡或肝臟受損修復過程中人類肝實質(zhì)組織細胞的起源給出了答案。

3 單細胞測序在肝臟炎癥反應和肝損傷研究中的應用

此前的研究表明，炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展與免疫細胞的募集和浸潤有關，但在慢性疾病期間免疫細胞如何對肝臟中發(fā)生的炎癥和免疫細胞浸潤做出反應還不得而知。Tamburini等[26]使用單細胞RNA測序和多光譜免疫熒光分析，證明了慢性肝病患者的淋巴管豐度增加，并且與纖維化和免疫細胞浸潤區(qū)域相關。同時，還發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細胞（LEC）在慢性肝病發(fā)展過程中會加快增殖，以維持組織穩(wěn)態(tài)。但是，當在脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）狀態(tài)下的氧化型低密度脂蛋白等炎癥信號增加時，淋巴功能下降，肝動態(tài)平衡受損。

在肥胖相關的非酒精性脂肪肝疾?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)展為脂肪性肝炎的過程中，肝臟和骨髓中的免疫細胞功能必定會受到影響發(fā)生變化。因此，深入表征脂肪肝中免疫細胞的功能適應性就極為必要。Krenkel等[27]利用單細胞RNA測序全面評估了非酒精性脂肪肝疾病期間肝臟和骨髓中髓樣細胞的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)肝和骨髓中存在不同的髓樣細胞簇。同時，肝髓樣區(qū)在NAFLD進展過程中逐漸適應了獨特的炎癥表型，并且肝臟和骨髓中的髓樣細胞具有功能上獨特的炎癥表型，其典型特征是巨噬細胞和樹突狀細胞亞群中的炎癥鈣結合蛋白基因（S100A8/A9）表達下調(diào)。這為進一步了解脂肪性肝炎打下了基礎。Xiong等[28]對健康和脂肪性肝炎小鼠肝臟細胞進行單細胞RNA測序研究，發(fā)現(xiàn)在脂肪性肝炎的肝臟中出現(xiàn)了與脂肪性肝炎相關的巨噬細胞（NASH-associatedmacrophages，NAM），并且其對藥理反應高度敏感。將其作為小鼠和人類脂肪性肝炎的標志，是我們了解、治療和預防脂肪性肝炎的重要理論依據(jù)。

肝臟是人體最大的實體器官，肝臟損傷會導致一連串的炎癥事件。為了在單細胞水平上更深入了解肝臟受損狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組信息，Chang等[29]利用單細胞RNA測序探索肝膽汁淤積性損傷期間肝細胞亞型和獨特功能，發(fā)現(xiàn)肝損傷期間表達細胞外基質(zhì)基因的肝細胞可能經(jīng)歷了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時，膽汁淤積性肝細胞的4個簇（BDL-2、BDL-3、BDL-4和 BDL-5）以炎癥調(diào)節(jié)、組織修復等不同方式參與了炎癥過程。這些結果提供了更多對受損肝中肝細胞獨特功能的認識，對肝細胞的未來優(yōu)化治療提供了理論依據(jù)。肝臟主要的上皮細胞如肝細胞和膽管上皮細胞（biliary epithelial cells，BEC）等在肝損傷再生過程中起重要作用，Pepe-Mooney等[30]使用單細胞RNA測序檢查了肝臟組織穩(wěn)態(tài)時和損傷后的膽管上皮細胞和肝細胞異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)時膽管上皮細胞有著顯著的異質(zhì)性，反映了YAP信號依賴性程序的激活，而YAP信號是肝細胞在損傷后重編程為膽管祖細胞所必需的，這種轉(zhuǎn)錄特征定義了細胞在體內(nèi)平衡過程中的動態(tài)變化，并且對損傷具有高響應性。

4 單細胞測序在肝纖維化研究中的應用

肝纖維化的發(fā)生往往是由于長期炎癥以及反復的肝損傷等導致纖維發(fā)生和纖維溶解之間的不平衡，形成纖維結節(jié)，從而破壞了肝臟結構、再生潛能和肝功能，長時間持續(xù)纖維化最終可能會向肝硬化、腫瘤等癥狀進一步惡化。因此，在單細胞分辨率水平解析肝纖維化狀態(tài)下的肝臟組織，會為我們理解、治療和預防肝纖維化提供強大的理論基礎。Dobie等[31]使用單細胞RNA測序?qū)】岛屠w維化小鼠肝臟中的肝間充質(zhì)細胞進行測序，揭示了跨肝小葉的星狀細胞（HSC）的空間分區(qū)，表明阻斷LPAR1后會抑制脂肪肝動物模型中的肝纖維化，從而確定了LPAR1為抑制膠原蛋白產(chǎn)生的治療靶標，同時高精度地解析了驅(qū)動肝纖維化的關鍵膠原生成細胞。同時，Krenkel等[32]將肝纖維化小鼠體內(nèi)靜息的星狀細胞和活化的成纖維細胞，與體外培養(yǎng)的成纖維細胞通過單細胞RNA測序進行比較，表征了纖維化狀態(tài)下星狀細胞和成纖維細胞的高度異質(zhì)性，鑒定了肝纖維化中星狀細胞和成纖維細胞亞型的存在。這些研究讓我們從單細胞角度對肝纖維化狀態(tài)下肝臟環(huán)境有了新的認識，這可能為未來預防和治療肝纖維化、肝硬化等疾病提供機會。

5 單細胞測序在肝臟腫瘤研究中的應用

在全球范圍內(nèi)，肝癌是最常見的致命惡性腫瘤[33]，其高異質(zhì)性、耐藥性、增殖轉(zhuǎn)移迅速、免疫微環(huán)境復雜等特征一直是造成疾病難以治愈的重要原因。為了了解腫瘤異質(zhì)性與腫瘤相關的形態(tài)學、組織學特征間的關系，Duan等[34]使用單細胞全基因組測序分析了乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染相關肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的男性腫瘤細胞和正常肝細胞，發(fā)現(xiàn)特定的HCC可能是單克隆或多克隆來源，起始克隆的早期肝內(nèi)擴散會導致同步多灶性腫瘤的形成。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了肝細胞癌中多種不同的腫瘤進化機制，針對不同的腫瘤模型，需要特定的治療策略。針對肝細胞癌免疫微環(huán)境復雜這一現(xiàn)象，Zhang等[35]結合2種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術，從5個免疫相關位點檢測了肝細胞癌的CD45+免疫細胞轉(zhuǎn)錄組信息，揭示了各種CD45+免疫細胞類型的動態(tài)特性，為我們對肝細胞癌復雜免疫環(huán)境的認識增加了新的維度。為了解析癌組織肝轉(zhuǎn)移性的機制，Zhang等[36]對從大腸癌患者體內(nèi)檢測出的肝轉(zhuǎn)移癌組織和鄰近組織的樣品進行了單細胞測序研究，分析了癌細胞和T細胞群體的動態(tài)變化途徑以及相關基因的表達與患者存活率的相關性，同時發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路被激活并促進了粒細胞遷移。這為闡明腫瘤的微環(huán)境組成，以及大腸癌肝轉(zhuǎn)移機制鋪平了道路。

近年來，逐漸興起的腫瘤免疫療法進入大眾視線，其關鍵在于腫瘤浸潤淋巴細胞在腫瘤中的分布以及預測其在癌癥中可能造成的臨床反應。因此，Zheng等[37]對6名肝細胞癌患者的外周血、腫瘤和鄰近正常組織中的T細胞進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)在肝臟腫瘤組織中，特定的T細胞亞群（如CD8+T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞）被優(yōu)先富集并且克隆擴增，另外鑒定出LAYN基因在活化的CD8+T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞中表達上調(diào)，并抑制CD8+T細胞的功能。這組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為了解癌癥的免疫狀況提供了寶貴的見解和豐富的資源。在肝癌相關研究中，有大量報道表明，較高數(shù)量的循環(huán)腫瘤細胞（circulatingtumor cells，CTC）與不良的臨床結果之間存在直接的相關性[38]，但對于CTC完整分子特征的研究卻很少。因此，D'Avola等[39]使用高密度單細胞轉(zhuǎn)錄組測序來表征肝癌患者中的CTC，證明了循環(huán)腫瘤細胞的異質(zhì)性，這有助于檢測HCC中已知的致癌驅(qū)動程序，并為使用液體活檢開發(fā)肝癌生物標志物提供了全新的工具。針對腫瘤內(nèi)高度異質(zhì)性這一現(xiàn)狀，Ho等[40]使用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析腫瘤內(nèi)細胞異質(zhì)性以檢測具有重要意義的稀有細胞亞群，發(fā)現(xiàn)根據(jù)EPCAM基因的表達高低可分出2個不同的主要細胞群，即CD24+和CD44+的細胞，表明肝細胞癌組織中可能存在與腫瘤增殖相關的新型細胞亞群。

隨著單細胞測序技術的不斷改善，單細胞基因組、DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組測序方法都日漸成熟，但是，要同時準確分析單個哺乳動物細胞的基因組拷貝數(shù)變異，DNA甲基化組、轉(zhuǎn)錄組及其之間相互調(diào)節(jié)的機制，這些組學方法需要在同一細胞中進行。因此，Hou等[41]使用單細胞三重基因組測序技術（single-cell triple omics sequencing，scTrio-seq）研究人類肝細胞癌組織樣品中的癌細胞，發(fā)現(xiàn)其中有2個亞群，其DNA拷貝數(shù)、DNA甲基化和RNA表達水平均不同。同時發(fā)現(xiàn)大規(guī)模的基因組拷貝數(shù)變異會導致獲得或丟失的基因組區(qū)域內(nèi)基因的RNA表達成比例變化，而這些基因組拷貝數(shù)變異通常不會影響這些區(qū)域的DNA甲基化。這為剖析基因組和表觀基因組異質(zhì)性對細胞群中轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的影響提供了新方向。

6 結語

在過去的幾年里，單細胞捕獲技術取得了顯著進步，諸如微移液、梯度稀釋、顯微操作、流動輔助細胞分選等新方法在不斷引入和改善，其中微流控平臺被廣泛應用于分離單個細胞，取得了巨大的成功[42]，但在組織解離過程中對單細胞轉(zhuǎn)錄組信息的影響還不得而知。另外，避免酶蛋白水解并最小化解離過程導致的基因表達變化，可能對我們分析細胞轉(zhuǎn)錄組，特別是解離敏感細胞的轉(zhuǎn)錄組，具有明顯的幫助。

單細胞測序技術已成為一種在細胞水平上解構復雜組織的強大工具。在這項技術出現(xiàn)之前，幾乎沒有對肝臟組織以單細胞分辨率進行的研究，這極大地限制了對肝臟正常生理功能和疾病狀態(tài)的分子水平的理解。目前可用的各種單細胞測序技術中，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是最成熟，也是應用最頻繁和最廣泛的方法。它利用更先進的技術檢測單個細胞中詳細的轉(zhuǎn)錄組信息，其研究方向包括惡性腫瘤、免疫反應和基質(zhì)細胞亞群，以及促進侵襲和轉(zhuǎn)移的細胞間相互作用等。

應用這項技術對正常和疾病狀態(tài)下肝臟結構的單細胞水平解析以及肝臟相關疾病的發(fā)展惡化機制研究也在不斷層層深入，如在鑒定新細胞亞群、解析細胞間高度異質(zhì)性、探索細胞發(fā)育軌跡、發(fā)現(xiàn)全新炎癥和腫瘤標志物、認識腫瘤免疫微環(huán)境、定位疾病發(fā)展惡化的關鍵細胞類型等方面，都有了許多新的發(fā)現(xiàn)。但同時，有幾個關鍵問題制約了這項技術在肝臟研究中的應用。首先，就是難以獲取新鮮肝臟組織；其次，肝臟組織中的一些易受剪切力、離心力等刺激的細胞類型（如肝實質(zhì)細胞、肝竇內(nèi)皮細胞等）在單細胞懸液制備過程中極易發(fā)生應激反應，這對最終細胞基因表達是否有影響還不得而知；另外，還可能致使有些細胞類型全部死亡，這會掩蓋對這一細胞類型的探索，一定程度上破壞了組織結構解析的完整性。

單細胞測序領域正在迅速發(fā)展，基礎化學和平臺技術不斷取得的新進展使人們能夠以前所未有的分辨率研究單個細胞。未來這一技術無疑將在精準醫(yī)學領域發(fā)揮越來越重要的作用，并將為了解組織發(fā)育、腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、治療耐藥性的發(fā)展、腫瘤轉(zhuǎn)移和演變的遺傳驅(qū)動因素提供機會。隨著新技術允許每個實驗捕獲更多數(shù)量的細胞，以及多種實驗方法的結合，一次提取出的細胞信息也會越來越多，這種趨勢可能會持續(xù)下去。可以預見的是，大規(guī)模、高通量將是下一步單細胞測序技術的發(fā)展方向。與此同時，其成本的下降和應用領域的拓展，會使該技術得到更廣泛的應用，甚至有可能在將來的某一天徹底改變我們對疾病研究的方式。