李素芬，王唯斯，楊娜，梅雯，孫美濤，熊偉

1.大理大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，云南 大理 671000；2.楚雄州人民醫(yī)院 病理科，云南 楚雄 675000；3.杭州醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學教研室，浙江 杭州 310053

腦膠質(zhì)瘤是成人中最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，可發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的任何位置，主要在大腦的神經(jīng)膠質(zhì)組織中[1]。腦膠質(zhì)瘤占所有系統(tǒng)性惡性腫瘤的2%～4%，約占所有腦瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%，以及所有惡性腦瘤的75%[2]。腦膠質(zhì)瘤細胞一般是星形細胞、少突膠質(zhì)細胞，或者是這2種細胞類型同時存在。通常根據(jù)國際疾病分類腫瘤學專輯第3版（ICD-O-3）和世界衛(wèi)生組織（WHO）等級進行疾病分類[3]。腦膠質(zhì)瘤惡性程度可達到WHO的Ⅰ～Ⅳ級。成人中最常見的腦膠質(zhì)瘤組織學類型包括星形細胞瘤（Ⅰ～Ⅳ級）、少突膠質(zhì)細胞瘤（Ⅱ～Ⅲ級）和少星形膠質(zhì)細胞瘤（Ⅱ～Ⅲ級），其中低級別腦膠質(zhì)瘤包括WHOⅠ級和Ⅱ級[3]。一般而言，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率約為每年100 000例，包括6種類型的腦瘤，并且每年診斷出17 000例多形性膠質(zhì)母細胞瘤新病例[4]。盡管在綜合治療方面取得了重大進展，但腦膠質(zhì)瘤患者的5年預后仍然很差[5-6]。

在真核生物中，所有mRNA以及幾種非編碼RNA如snRNA、snoRNA、siRNA的轉(zhuǎn)錄，都是通過RNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）實現(xiàn)的[7]。人類RNA polⅡ由12個亞基組成，最大的催化亞基為POLR2A，也稱為RPB1。人POLR2A基因位于染色體17p13.1上，編碼產(chǎn)物由1970個氨基酸殘基構(gòu)成，相對分子質(zhì)量為220×103，包含有52個七肽重復序列（YSPTSPS）的C端結(jié)構(gòu)域（CTD），這對于聚合酶活性至關(guān)重要[8-9]。已經(jīng)廣泛研究了CTD修飾，如Ser2和Ser5的磷酸化，這些修飾在轉(zhuǎn)錄的各個步驟（包括起始、暫停、延伸和終止）動態(tài)發(fā)生[7-9]。現(xiàn)已確定，POLR2A，特別是它的CTD結(jié)構(gòu)域，在協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄與共轉(zhuǎn)錄（例如mRNA加工），從而調(diào)節(jié)基因表達中起關(guān)鍵作用[10]。因此，POLR2A的缺失將導致基因表達失調(diào)，從而導致細胞死亡。此外，據(jù)報道，基于微陣列分析，與年輕的供體細胞相比，Werner綜合征患者或老年人的供體細胞中的POLR2A顯著下調(diào)，表明其在細胞衰老中的作用[11]。POLR2A中反復的體細胞突變可驅(qū)動腦膜瘤進展，提示它可能在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用[12]。POLR2A在基因表達和細胞功能中具有重要地位，但除了由泛素化介導的DNA損傷依賴性或非依賴性POLR2A降解外，對其自身的調(diào)控知之甚少[13-16]。目前，關(guān)于POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤中的研究還未見相關(guān)報道。在本研究中，我們通過不同的腫瘤生物信息數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘，分析了POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤中的表達及其預后意義。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫提取POLR2A基因與低級別腦膠質(zhì)瘤相關(guān)數(shù)據(jù)

Oncomine數(shù)據(jù)庫（http://www.oncomine.org）是基于基因芯片和整合數(shù)據(jù)挖掘的平臺，通過計算基因表達特征、集群和基因集模塊，從數(shù)據(jù)中自動提取生物信息[17]。本研究中我們設(shè)定數(shù)據(jù)集篩選條件如下：①Gene：POLR2A；②Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；③Cancer Type：Astrocytoma，Oligodendroglial Tumor，Mixed Glioma；④Date Type：mRNA；⑤Simple Type：Clinical Specimen；⑥ 臨 界 值 設(shè) 定 條 件 ：Pvalue＜1E-4，fold change 2，gene rank=top10%。

1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤中的表達

通過在Oncomine數(shù)據(jù)庫所提取出的數(shù)據(jù)集，進一步分析POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達。

1.3 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析POLR2A基因在各腫瘤組織中的表達

基因表達譜動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn）包含許多腫瘤及正常樣本的RNA序列表達數(shù)據(jù)[18]。通過GEPIA分析POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達差異，同時分析人體中其他部位的腫瘤組織及其相對應的正常組織中POLR2A基因的表達差異。

1.4 cBioportal數(shù)據(jù)庫分析POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤組織中的突變

cBioprotal數(shù)據(jù)庫（http://www.cbioportal.org/）是Memorial Sloan Kettering Cancer Center（MSK）開發(fā)的基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫的一款集數(shù)據(jù)挖掘、數(shù)據(jù)整合及可視化等多功能于一體的綜合性開放網(wǎng)絡平臺[19]。使用cBioportal進行癌癥基因組學分析，分析TCGA數(shù)據(jù)庫（http://cancergenome.nih.gov）低級別腦膠質(zhì)瘤患者POLR2A基因突變率。

1.5 OncoLnc數(shù)據(jù)庫分析POLR2A基因的表達與低級別腦膠質(zhì)瘤患者預后的關(guān)系

OncoLnc（https://www.oncolnc.org）數(shù)據(jù)庫是對癌癥數(shù)據(jù)集進行Kaplan-Meier生存分析的在線工具[20]。選擇TCGA數(shù)據(jù)集中的LGG項目，輸入POLR2A基因，高表達組與低表達組均設(shè)置為33%，得到168例POLR2A基因高表達和168例POLR2A基因低表達的低級別腦膠質(zhì)瘤樣本，進行Kaplan-Meier分析。

1.6 String-DB數(shù)據(jù)庫分析與POLR2A蛋白相互作用的蛋白質(zhì)

String-DB數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）可以分析基因或蛋白質(zhì)的相互作用，數(shù)據(jù)庫中的生物數(shù)據(jù)和網(wǎng)絡資源都已被證實或者可以預測[21]。利用String-DB數(shù)據(jù)庫分析POLR2A蛋白在真核生物轉(zhuǎn)錄中相互作用的蛋白質(zhì)。

1.7 統(tǒng)計學分析

正常腦組織和對應的低級別腦膠質(zhì)瘤組織之間POLR2A表達的差異采用t檢驗；POLR2A表達與低級別腦膠質(zhì)瘤預后的關(guān)系采用Kaplan-Meier分析。所用統(tǒng)計學分析采用SPSS24.0進行，P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 POLR2A在低級別腦膠質(zhì)瘤中的表達

Oncomine數(shù)據(jù)庫顯示，在有關(guān)低級別腦膠質(zhì)瘤的基因芯片中，選擇了7項涉及POLR2A基因的研究，相關(guān)文獻分別發(fā)表于Cancer Res、Oncogene、Cancer Cell雜志。分析這7項研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，POLR2A mRNA在低級別腦膠質(zhì)瘤組織中呈高表達，P=0.022（圖1）。

2.2 POLR2A在低級別腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織的表達差異

對Oncomine數(shù)據(jù)庫中不同類型腦膠質(zhì)瘤芯片的分析發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，不同類型腦膠質(zhì)瘤組織中的POLR2A呈現(xiàn)高表達（圖2）。

2.3 GEPIA分析POLR2A基因在人體各種腫瘤中的表達差異

通過GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫中低級別腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集，結(jié)果表明，與正常腦組織相比，POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤組織中呈高表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫中POLR2A基因在人體31種腫瘤組織及其相應的正常組織中的表達差異，結(jié)果顯示，POLR2A基因在很多人體腫瘤組織中呈高表達（圖4）。

2.4 cBioportal分析POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤組織中的突變

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中7項研究顯示POLR2A基因在正常腦組織（對照組）與低級別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達差異

使用cBioportal數(shù)據(jù)庫分析腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集Glioma（UCSF）、LGG（TCGA PanCan）、Glioma（TCGA）、LGG-GBM（TCGA 2016）低級別腦膠質(zhì)瘤組織中POLR2A的基因突變，觀察到POLR2A的高突變率（圖5）。

2.5 OncoLnc數(shù)據(jù)庫中Kaplan-Meier生存分析

圖2 POLR2A在低級別腦膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織的表達差異

OncoLnc數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果顯示，POLR2A基因的表達水平對低級別腦膠質(zhì)瘤患者的總生存時間無顯著影響。與POLR2A基因高表達組相比，POLR2A基因低表達的低級別腦膠質(zhì)瘤患者總體生存率無明顯變化（LogrankP=0.454）（圖6）。

2.6 與POLR2A蛋白相互作用的蛋白質(zhì)

String-DB分析發(fā)現(xiàn)，POLR2A在真核生物基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用，PPI富集P=0.056，節(jié)點數(shù)為11（圖7）。與POLR2A蛋白有相互作用的蛋白質(zhì)為真核生物RNA聚合酶2E（POLR2E）、2F（POLR2F）、2G（POLR2G）、2K（POLR2K）、2L（POLR2L）。

3 討論

圖3 正常腦組織和低級別腦膠質(zhì)瘤組織中POLR2A mRNA的表達差異（*P＜0.05）

圖4 人體各種腫瘤組織及其相應正常組織中POLR2A基因的表達差異

圖5 POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤組織中的突變

圖6 OncoLnc數(shù)據(jù)庫低級別腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集中POLR2A表達量與患者預后的Kaplan-Meier生存分析

圖7 真核生物轉(zhuǎn)錄過程中與POLR2A相互作用的蛋白質(zhì)

腦膠質(zhì)瘤按惡性程度可達到WHO的Ⅰ～Ⅳ級。成人中最常見的腦膠質(zhì)瘤組織學類型包括星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤和少星形膠質(zhì)細胞瘤。其中低級別膠質(zhì)瘤生長緩慢，是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)支持性膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的異質(zhì)性神經(jīng)上皮腫瘤，占所有原發(fā)性腦腫瘤的10%～20%。一般情況下，低級別腦膠質(zhì)瘤WHOⅠ級可以通過手術(shù)切除治愈，WHOⅡ級包括星形細胞瘤、少突膠質(zhì)瘤和混合性少突膠質(zhì)細胞瘤，很少能治愈[22]。低級別腦膠質(zhì)瘤雖進展緩慢，但具有向高度惡性轉(zhuǎn)化的潛力，可轉(zhuǎn)化為高級別膠質(zhì)瘤[23]。在真核生物中，POLR2A協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄與共轉(zhuǎn)錄，在調(diào)節(jié)基因表達和細胞功能中發(fā)揮重要作用。由于POLR2A中反復的體細胞突變可驅(qū)動腦膜瘤進展，提示它可能在腫瘤發(fā)生中起作用，而POLR2A與低級別腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展及其預后的關(guān)系目前未見報道。

我們利用Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫對POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達進行了匯總分析。通過探究Oncomine數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，POLR2A在低級別腦膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，提取Oncomine數(shù)據(jù)庫中POLR2A mRNA在低級別腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織的表達情況，顯示POLR2A在不同類型的低級別腦膠質(zhì)瘤組織中均高表達，且差異具有統(tǒng)計學意義。GEPIA分析結(jié)果表明，與正常腦組織相比，腦膠質(zhì)瘤組織中POLR2A的表達水平顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學意義。利用OncoLnc數(shù)據(jù)庫分析POLR2A基因的表達水平如何影響低級別腦膠質(zhì)瘤患者的總生存時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與POLR2A基因高表達組相比，POLR2A基因低表達的低級別腦腦腦膠質(zhì)瘤患者總體生存時間無明顯變化，與預后無相關(guān)性。通過cBioportal分析發(fā)現(xiàn)，POLR2A基因在低級別腦膠質(zhì)瘤組織中存在高突變率。最后，通過String-DB數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，真核生物RNA聚合酶多個亞基與POLR2A之間存在相互作用。

隨著基因診療技術(shù)的不斷發(fā)展，分子靶向治療已成為臨床治療低級別腦膠質(zhì)瘤研究的熱點，這些數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果為后續(xù)的實驗研究提供了重要的理論基礎(chǔ)，也為進一步探究POLR2A在低級別腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機制，找到早期診斷的分子標志物，從而進行抗腫瘤靶向治療提供了理論依據(jù)。