張輝 ，冉磊 ，竇群立

1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥資源產業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；3.陜西中醫(yī)藥大學 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

糖尿病性骨質疏松（diabedic osteoporosis，DOP）是糖尿病在骨骼系統(tǒng)中的重要慢性并發(fā)癥之一，其患病率約占糖尿病患者的33%，且呈逐年上升的趨勢[1-2]。DOP作為一種全身代謝性疾病，主要表現(xiàn)為骨量降低、骨質下降、骨脆性增加、骨強度降低，常伴有腰背髖部疼痛、持續(xù)性肌肉鈍痛等癥狀。DOP患者骨折風險較非糖尿病患者顯著增高，而一旦出現(xiàn)骨折，由于患者的特殊機體狀態(tài)，大大增加了致殘率和致死率，嚴重威脅患者的生命健康，并給患者和社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔[3-4]。崔冉等[5]指出，對于DOP的治療不能單純降低血糖，還應結合抗骨質疏松藥物等方面的干預才能最大程度地提高骨密度，預防骨折的發(fā)生。

雷奈酸鍶（strontium ranelate，SR）是一種兼具促進骨形成和抑制骨吸收雙重作用的抗骨質疏松類藥物，憑借其良好的臨床藥效和生物利用度被臨床推廣使用[6-7]。研究表明，成骨細胞活性的抑制及其凋亡的增加是導致DOP發(fā)生發(fā)展的重要原因，而SR的促成骨機制與其對成骨細胞增殖和分化的促進作用息息相關[8]?；诖?，本研究通過體外實驗建立高糖環(huán)境誘導的成骨細胞損傷模型，通過對SR作用后成骨細胞的生物學活性、細胞凋亡水平、細胞形態(tài)以及骨形成相關基因與蛋白表達水平等進行探究，旨在系統(tǒng)評估SR對高糖誘導的成骨細胞損傷中的保護作用，以期為SR在治療DOP中的臨床應用提供科學合理的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

MC3T3-E1成骨細胞系保存于陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨科實驗室；胎牛血清購于杭州四季青公司；青/鏈霉素、α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于Gibco公司；MTT檢測試劑盒購于Sigma公司；SR購于Servier公司；細胞凋亡檢測試劑盒購于Beyotime公 司 ；TRIzol、PrimeScript RT 試 劑 盒 、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購于TaKaRa公司；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、胰 島 素 樣 生 長 因 子 1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）酶聯(lián)免疫試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 成骨細胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)MC3T3-E1成骨細胞系，細胞生長于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。待細胞密度達到80%后，用0.25%的胰蛋白酶傳代，取對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 高糖環(huán)境細胞模型構建

取對數(shù)生長期的成骨細胞制成細胞懸液，以1×105/mL接種于96孔板，待細胞充分貼壁后，分別換為含 0、10、30、50、80、100 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液，每組設置6個復孔，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；隨后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，在37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；每孔加入150 μL DMSO溶液并充分振蕩以促進晶體溶解，測定D570nm值，以明確能夠造成成骨細胞活性顯著降低的最優(yōu)葡萄糖濃度。細胞活性=［（加藥組D570nm-空白組D570nm）/（加藥組D570nm-空白組D570nm）］×100%。

1.4 SR對成骨細胞活性的影響

將成骨細胞以1×105/mL接種于96孔板，待細胞充分貼壁后，分別加入 0.00、0.05、0.50、5.00、50.00、500.00 mmol/L SR溶液，每種濃度設置6個復孔，于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用MTT法檢測細胞增殖能力。實驗重復3次。

1.5 SR對高糖環(huán)境誘導的成骨細胞增殖能力的影響

實驗分為3組，即對照組、高糖（HG）組、高糖+雷奈酸鍶（HG+SR）組。HG組細胞使用含80 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；HG+SR組細胞在用含相同濃度葡萄糖的完全培養(yǎng)液進行孵育的同時，分別加入0.05、0.50、5.00、50.00、500.00 mmol/L SR 溶液，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；對照組細胞培養(yǎng)于相同環(huán)境下，不施加任何干預。每組均設置6個復孔，實驗共重復3次。

1.6 細胞凋亡水平檢測

采用細胞凋亡檢測試劑盒對成骨細胞的凋亡水平進行檢測分析。將對照組、HG組和HG+SR組細胞配置為1×106/mL濃度，分別加入500 μL結合緩沖液、5 μL AnnexinⅤ-FITC溶液和5 μL碘化丙啶（PI）溶液，充分混勻并避光反應20 min，用流式細胞儀對各凋亡階段的成骨細胞數(shù)量進行定量分析。

1.7 細胞形態(tài)學觀察

采用倒置光學顯微鏡（Olympus CKX31型）觀察對照組、HG組和HG+SR組成骨細胞的細胞形態(tài)。每組隨機選擇5個視野，用20倍鏡采集圖像，并對每個視野中的細胞數(shù)量進行定量分析。

1.8 RNA提取及qRT-PCR檢測

將對照組、HG組和HG+SR組成骨細胞以2×105/mL接種于6孔板，待細胞密度達到80%后，用TRIzol試劑裂解各組細胞并提取總RNA，以2.5 μg上樣量，采用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。隨后以β-actin為內參基因，用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒和CFX Connect型qRT-PCR儀對樣本進行基因擴增，采用 2-ΔΔCt法分析目的基因的表達水平。引物相關序列見表1。

1.9 酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測

采用ELISA試劑盒對各組成骨細胞的BMP-2和IGF-1蛋白分泌情況進行檢測。收集各組成骨細胞的培養(yǎng)液，向酶標板的樣本孔中分別加入稀釋至1/5的上清液各50 μL，同時向標準品孔中依次加入 0、12.5、25、50、100 pg/mL 的標準品各 50 μL，并向每孔加入100 μL酶標試劑，每組樣本設置3個復孔。用封板膜封板后將酶標板置于37°C細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用洗滌液對樣本和標準品孔進行漂洗。隨后分別依次加入顯色劑A、B液各50 μL，充分混勻后避光孵育15 min。最后，向每孔加入50 μL終止液終止反應，用酶標儀檢測各樣本的D450nm值。

表1 qRT-PCR引物及序列

圖1 不同濃度高糖環(huán)境對成骨細胞活性的影響

1.10 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，用SPSS19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析檢測組間差異，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高糖環(huán)境對成骨細胞活性的影響

不同濃度的葡萄糖對成骨細胞活性的影響如圖1所示。方差分析結果表明差異具有統(tǒng)計學意義（F=22.046，P＜0.001），說明不同濃度的葡萄糖對成骨細胞活性的抑制作用不同。Dunnett-t檢驗結果表明，10、30 μmol/L的葡萄糖對成骨細胞活性無顯著抑制效果（P＞0.05）；而用50、80及100 μmol/L的葡萄糖對MC3T3-E1成骨細胞誘導3 d后，成骨細胞活性較對照組均顯著降低，抑制率分別為39.66%±4.89%（P=0.001）、66.89%±8.66%（P＜0.001）、76.89%±4.70%（P＜0.001）。

2.2 不同濃度SR對成骨細胞活性的影響

圖2 不同濃度SR對成骨細胞活性的影響

不同濃度的SR對成骨細胞活性的影響如圖2所示。方差分析結果表明差異具有統(tǒng)計學意義（F=26.303，P＜0.001），說 明 不 同 濃 度 的 SR 對MC3T3-E1成骨細胞活性的作用效果不同。Dunnett-t檢驗結果表明，0.05和5.00 mmol/L的SR對MC3T3-E1細胞活性的促進作用較對照組均無明顯差異（P=0.406），50.00和500.00 mmol/L的SR則對MC3T3-E1細胞活性表現(xiàn)出顯著的抑制作用（P＜0.001）。

2.3 不同濃度SR對高糖環(huán)境誘導的成骨細胞增殖能力的影響

研究表明，MC3T3-E1細胞在含80 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液的高糖環(huán)境下細胞活性較對照組均被顯著抑制（F=21.051，P＜0.001）；而用不同濃度的SR對高糖環(huán)境下的MC3T3-E1細胞進行3 d干預后，0.50與50.00 mmol/L的SR對高糖損傷的成骨細胞具有顯著的保護作用（P＜0.001，P=0.016），0.05與500.00 mmol/L的SR對高糖作用后的成骨細胞則無顯著保護作用（P＞0.05），且高濃度SR作用后會加重高糖對成骨細胞活性的損傷作用。

2.4 SR對高糖環(huán)境誘導的成骨細胞凋亡水平的影響

圖3 不同濃度SR對高糖誘導的成骨細胞活性的保護作用

SR對高糖環(huán)境誘導的MC3T3-E1成骨細胞各凋亡細胞分布圖及其對應的統(tǒng)計結果如圖4所示。當用含80 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液對成骨細胞進行孵育后，HG組細胞的凋亡率（28.92%±1.27%）較對照組（7.49%±0.86%）顯著增加（P＜0.001）。當用能夠對高糖環(huán)境誘導的成骨細胞活性具有顯著保護效果的0.50 mmol/L的SR對細胞進行孵育后，HG+SR組細胞的凋亡率（20.05%±1.38%）較HG組顯著降低（P=0.006），與對照組相比具有統(tǒng)計學差異（P=0.012）。實驗結果表明SR能夠有效降低高糖環(huán)境對MC3T3-E1細胞的損傷，對細胞具有一定程度的保護作用。

2.5 SR對高糖環(huán)境誘導的成骨細胞形態(tài)學的影響

圖4 SR對高糖誘導的成骨細胞凋亡水平的影響

圖5 SR對高糖誘導的成骨細胞形態(tài)結構的影響

對MC3T3-E1細胞的形態(tài)學觀察結果如圖5所示。對照組細胞形態(tài)較完整，細胞密度較大，多呈星型，多數(shù)細胞的延展性較好。當用含80 μmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)液對細胞進行損傷后，HG組細胞密度降低，細胞皺縮，細胞表面積縮??；而當用0.50 mmol/L的SR對高糖環(huán)境下生長的細胞進行保護后，HG+SR組細胞形態(tài)較HG組明顯改善，細胞延展性有一定程度的恢復，細胞表面積增大，但細胞密度較對照組仍明顯降低。

2.6 SR對高糖環(huán)境誘導的成骨細胞相關基因表達水平的影響

SR對高糖誘導的成骨細胞相關基因表達水平的影響如圖6所示。80 μmol/L葡萄糖的高糖環(huán)境顯著降低了MC3T3-E1成骨細胞的Runt相關轉 錄 因 子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）和Ⅰ型膠原蛋白（collagen-1，COL-1）的mRNA水平（P=0.016，P=0.038，P=0.012）；而用0.50 mmol/L的SR對細胞進行保護后，HG+SR組細胞的Runx2、OCN和COL-1的mRNA表達水平均較HG組顯著增加（P=0.008，P=0.022，P=0.040）。

2.7 SR對高糖環(huán)境誘導的成骨細胞相關蛋白分泌水平的影響

SR對高糖誘導的成骨細胞BMP-2和IGF-1蛋白分泌水平的影響如圖7所示。80 μmol/L葡萄糖能夠使BMP-2和IGF-1的蛋白分泌水平被顯著抑制（P=0.002，P=0.035），而0.50 mmol/L的SR則能夠顯著逆轉BMP-2和IGF-1蛋白分泌水平的降低（P=0.002，P=0.035）。

3 討論

DOP是嚴重的糖尿病并發(fā)癥，患者的骨量顯著減少，骨微結構被破壞，骨折風險大大增加。據(jù)報道，1型糖尿病患者骨量減少和DOP發(fā)病率為48%～72%，2型糖尿病患者DOP發(fā)病率為20%～60%，且骨質丟失速率顯著增加[9-10]。因此，積極探索合理有效的DOP治療手段，對于改善DOP患者生存質量、降低其致殘率和致死率具有重要的臨床意義。目前治療糖尿病的藥物主要包括胰島素及各種降血糖藥物，而一些降血糖藥物如磺胺類藥物、噻唑烷二酮類藥物等還能夠造成骨質的流失[11-12]，因此對于DOP的治療還應結合抗骨質疏松類藥物進行。SR是一種具有促骨形成和抗骨吸收雙重作用的骨質疏松治療藥物，大量體內實驗均證實SR加速新骨形成、促進不同狀態(tài)大鼠/小鼠的骨質增加[13]，體外實驗也表明SR能夠有效降低破骨細胞分化，同時加速成骨細胞表型的獲得[14-15]。此外，大量臨床實驗證實SR絕經(jīng)后骨質疏松癥具有一定程度的治療作用，從而大大降低了患者髖骨和椎骨的骨折風險[16-17]。然而，有關SR對于DOP作用效果的研究目前國內外尚未見相關報道。本研究中，我們通過對體外培養(yǎng)的成骨細胞進行高糖誘導，探究不同濃度的高糖溶液和SR對成骨細胞活性的作用效果，篩選出能夠誘導成骨細胞活性顯著降低的高糖濃度（80 μmol/L）以及對成骨細胞活性具有顯著促進作用的SR濃度（0.50 mmol/L），并探討了該濃度SR對高糖誘導的成骨細胞的細胞活性、形態(tài)結構及細胞功能的保護作用，旨在為SR在DOP臨床治療中的應用提供科學合理的實驗依據(jù)。

圖6 SR對高糖誘導的成骨細胞相關基因表達的影響

圖7 SR對高糖誘導的成骨細胞相關蛋白分泌水平的影響

研究表明，糖尿病患者體內的高血糖環(huán)境對骨骼細胞具有重要影響。長期處于高血糖狀態(tài)的機體，其骨代謝平衡被打破，高濃度的葡萄糖能夠抑制成骨細胞的增殖和分化[18]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境能夠顯著抑制成骨細胞增殖水平，而SR則能夠顯著促進高糖誘導的成骨細胞增殖水平的降低。此外，長期的高血糖環(huán)境能夠引發(fā)機體晚期糖基化終末產物（advanced glycation endproducts，AGEs）的形成和累積，從而促進成骨細胞凋亡并抑制其分化，增加骨膠原的糖化和骨脆性，進而降低骨強度[19]。本研究發(fā)現(xiàn)的高糖環(huán)境顯著增加成骨細胞的凋亡水平也證實了這一點，而SR對高糖誘導的細胞凋亡具有顯著的抑制作用，并且SR能夠顯著改善高糖誘導的成骨細胞形態(tài)學的退變，增加細胞延展性和細胞面積，表明SR對高糖誘導的成骨細胞損傷具有一定程度的保護作用。

Runx2、OCN和COL-1是骨發(fā)育過程中重要的轉錄調節(jié)因子，對骨形成和骨重建具有重要的調節(jié)作用。Runx2作為骨形成的關鍵調節(jié)因子，能夠促進早期成骨細胞的增殖和分化，并能影響其他骨形成相關細胞因子的分泌[20]；OCN是成骨細胞分化成熟的標志[21]，而COL-1參與膠原纖維的形成，同樣是骨形成的典型調節(jié)者[22]。本研究表明，高糖環(huán)境下成骨細胞的Runx2、OCN及COL-1的基因表達水平顯著降低，SR干預則顯著上調了三者的mRNA表達水平，而OCN和COL-1的表達上調很可能與Runx2的高表達有關。以上結果表明SR干預能夠通過促進骨形成相關細胞因子的表達而發(fā)揮對高糖誘導的成骨細胞損傷的保護作用，進而促進成骨細胞的分化與礦化，并對高糖環(huán)境下的骨形成產生一定程度的促進作用。BMP-2也是骨形成和骨傷愈合過程中重要的細胞因子之一，據(jù)報道BMP-2能夠顯著增加去勢大鼠的骨密度，改善骨骼的力學屬性[23-24]。IGF-1是骨骼中最豐富的生長因子，具有保護骨量、促進骨祖細胞和成骨細胞增殖與分化、加速骨礦化結節(jié)形成、抑制細胞凋亡的作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)SR能夠有效促進高糖誘導的成骨細胞BMP-2和IGF-1的分泌，進一步表明SR在改善成骨細胞活性、抑制細胞凋亡、促進骨形成的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究增加了科學界對于SR在高糖誘導的成骨細胞損傷中的保護作用及相關機制的認識，從而為SR在糖尿病機體中骨形成的促進作用提供了新見解，并為其在DOP臨床治療中的應用提供了合理的實驗依據(jù)。