鄭秀潔，張?jiān)茲?，?禮，劉洪巖，李炳乾，辛乃宏

(中鹽工程技術(shù)研究院有限公司，天津 300450)

芽孢桿菌是植物病害生防微生物的重要組成部分，具有顯著的生防潛力， 能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖。在穩(wěn)定性與化學(xué)農(nóng)藥的相容性等方面，明顯優(yōu)于非芽孢桿菌和真菌生防菌劑。近年來許多國家已經(jīng)成功商品化了一些優(yōu)良芽孢桿菌生防菌劑。美國有GB03、MB1600、FZB24和QST713四株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局(EPA)商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可[1]。

枯草芽孢桿菌在水體中繁殖的過程中能夠產(chǎn)生胞外酶，它能夠?qū)⑺w和底泥中的殘余餌料、排泄廢物和動(dòng)植物殘?bào)w等有機(jī)物分解，這些有機(jī)物首先分解為小分子，如高級(jí)脂肪酸和多肽等，然后分解為更小的分子有機(jī)物，如單糖、氨基酸、低級(jí)脂肪酸和環(huán)烴等，最終分解為二氧化碳、硝酸鹽、硫酸鹽等，從而降低了水中的 BOD 、COD，使水中的氮、氨、硫化物和亞硝酸氮的濃度降低，具有清除底泥和減輕水體富營養(yǎng)化的作用。此外芽孢桿菌分泌的多種抗生素和酶類都能抑制其它病原菌的生長[2-5]。

枯草芽孢桿菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖用添加劑，一些研究證明其能夠促進(jìn)養(yǎng)殖品種加速生長，降低飼料系數(shù)，維持腸道微生態(tài)平衡，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力，提高抗病能力和減少污染等[6]。

文章對(duì)枯草芽孢桿菌的高密度發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過對(duì)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并對(duì)溫度、pH值優(yōu)化確定了其高密度發(fā)酵的最佳條件。

1 材料和方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌，來自天津市水產(chǎn)研究所。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基及條件

葡萄糖5 g/L；玉米漿10 g/L；MnSO40.2 g/L；NaCl 2 g/L；K2HPO40.2 g/L；碳酸鈣2 g/L。培養(yǎng)溫度30 ℃；pH值7.0。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 碳源的優(yōu)化

選取葡萄糖分別為2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L,進(jìn)行葡萄糖優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行樣，其它培養(yǎng)條件如1.2所述，下同。

1.3.2 氮源的優(yōu)化

氮源的優(yōu)化首先選取玉米漿、豆餅粉，各為1%進(jìn)行比較，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行樣，確定氮源后按5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L共5個(gè)梯度進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.3 pH值優(yōu)化

設(shè)置pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共5個(gè)梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行樣。

1.3.4 溫度優(yōu)化

設(shè)置溫度為25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃共5個(gè)梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的優(yōu)化

如圖1所示，在所設(shè)定的7個(gè)葡萄糖濃度梯度中，枯草芽孢桿菌的干重隨著葡萄糖濃度的增大而增加，但當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到10 g/L時(shí)，再繼續(xù)增大葡萄糖濃度，枯草芽孢桿菌干重變化不大，考慮性價(jià)比，最終選定葡萄糖濃度為10 g/L。

圖1 葡萄糖濃度對(duì)枯草芽孢桿菌的影響Fig.1 The effect of glucose concentration on B.subtilis

2.2 氮源的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，圖2(a)為兩種氮源對(duì)枯草芽孢桿菌的影響，在相同濃度下，玉米漿作為氮源時(shí)枯草芽孢桿菌的干重稍大，但其芽孢率選低于豆餅粉作為氮源，故終選定豆餅粉作為枯草芽孢桿菌的氮源；圖2(b)為不同豆餅粉濃度對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響，當(dāng)枯草芽孢桿菌濃度為15 g/L時(shí)枯草芽孢桿菌干重為最大值，故枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中氮源選定為15 g/L的豆餅粉。

圖2 氮源對(duì)枯草芽孢桿菌的影響(a：兩種氮源對(duì)其的影響；b：豆餅粉濃度對(duì)其的影響)Fig.2 The effect of nitrogen on B.subtilis(a: the effect of different nitrogen; b: the effect of soybean cake powder)

2.3 pH值的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值為7.5時(shí)，枯草芽孢桿菌的干重為最大值，而當(dāng)pH值小于7.5時(shí)，枯草芽孢桿菌的干重隨著pH值的增大而增大；當(dāng)pH值大于7.5時(shí)，枯草芽孢桿菌的干重隨著pH值的增大而減小。因此在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵中pH值選定為7.5。

圖3 pH值對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響Fig.3 The effect of pH on B.subtilis

2.4 溫度的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，當(dāng)溫度增大時(shí)，枯草芽孢桿菌的干重也隨之增大，當(dāng)溫度達(dá)到32 ℃，繼續(xù)增大，枯草芽孢桿菌的干重變化不大。結(jié)合能耗比，選定最終培養(yǎng)溫度為32 ℃。

圖4 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響Fig.4 The effect of temperature on B.subtilis

3 結(jié)論

文章對(duì)枯草芽孢桿菌異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)的碳源、氮源、溫度以及pH值進(jìn)行了研究,得出以下結(jié)論:

1)通過對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵碳源的優(yōu)化，從枯草芽孢桿菌濃度變化曲線中可知，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到10 g/L時(shí)，再繼續(xù)增大葡萄糖濃度，枯草芽孢桿菌干重變化不大，考慮性價(jià)比，最終選定葡萄糖濃度為10 g/L。

2)通過對(duì)發(fā)酵液中氮源的優(yōu)化得知，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中氮源選定為15 g/L的豆餅粉。

3)從枯草芽孢桿菌的pH值優(yōu)化可知，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值為7.5時(shí)，枯草芽孢桿菌的干重為最大值，而當(dāng)pH值小于7.5時(shí)，枯草芽孢桿菌的干重隨著pH值的增大而增大；當(dāng)pH值大于7.5時(shí)，枯草芽孢桿菌的干重隨著pH值的增大而減小。因此在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵中pH值選定為7.5。

4)從對(duì)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)溫度的優(yōu)化得知，當(dāng)溫度增大時(shí)，枯草芽孢桿菌的干重也隨之增大，當(dāng)溫度達(dá)到32 ℃，繼續(xù)增大，枯草芽孢桿菌的干重變化不大。結(jié)合能耗比，選定最終培養(yǎng)溫度為32 ℃。