李富，寧學(xué)玲，陳海玲

1.茂名市婦幼保健院新篩中心，廣東 茂名 525000；

2.湛江市中心人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 湛江 524037

遺傳性耳聾是臨床常見的先天性耳聾，與遺傳性耳聾相關(guān)的基因突變位點(diǎn)較多，臨床常用酶切法和直接測(cè)序法較難同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因突變位點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)高效、快速、方便，是高通量基因檢測(cè)方法，適合大規(guī)模人群進(jìn)行遺傳性耳聾基因篩查[1]。我國(guó)漢族人群耳聾患者最常見的基因突變是縫隙連接蛋白β2基因(GJB2)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)體26A4蛋白基因(SLC26A4)、GJB3、線粒體mtDNA 12s rRNA等[2]，但是不同地區(qū)耳聾基因突變具有顯著差異性。為了解茂名地區(qū)耳聾相關(guān)基因突變特點(diǎn)，本研究采用干血斑基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)170例遺傳性耳聾患者進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年5月至2019年3月茂名地區(qū)醫(yī)院優(yōu)生優(yōu)育遺傳醫(yī)學(xué)中心門診篩查的5 542例漢族兒童為研究對(duì)象，其中210例復(fù)查，共170例遺傳性耳聾患兒納入研究，排除伴智力障礙、顱腦占位性病變、綜合征聾、外耳與中耳畸形患兒。所有患兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書。170例遺傳性耳聾患兒中男性104例，女性66例；年齡2~8歲，平均(4.56±2.05)歲；聽力損失程度：輕度聽力損失(26~40 dBHL)40例，中度聽力損失(41~60 dBHL)45例，重度聽力損失(61~80 dBHL)47例、極重度聽力損失(>80 dBHL)38例。另選擇篩查健康的漢族兒童60為對(duì)照組，男性37例，女性23例；年齡2~7歲，平均(4.49±2.16)歲，聽力均正常。兩組受試者年齡、性別分布比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 干血斑DNA提取 采集受試者末梢靜脈血，移液器取自然下落血滴(約50μL)于Whatman903濾紙，血斑直徑8 mm，保證濾紙兩面充分滲透，室溫下自然干燥，每單張?jiān)嚰埛湃胱苑獯鼉?nèi)，室溫干燥保存待檢。采用離心柱型血液DNA提取試劑盒(潮州凱普)提取干血斑DNA，打孔器打取直徑3 mm干血斑3片，每份加200μL(緩沖液)和20μL蛋白酶K，震蕩混勻，56℃溫浴20 min，加入200μL無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入帶硅膠離心柱，10 000 r/min離心1 min然后，利用洗液W1洗脫1次，洗液W2洗脫2次，利用TE洗脫液獲取DNA液60μL，將Taq酶分別加入到A組和B組PCR mix中配置總反應(yīng)體系，混勻，點(diǎn)動(dòng)離心，按照A組(28μL)和B組(28μL)的體系分別分裝到0.2 mL PCR管中，將臨床DNA按順序加入到A組和B組體系中。A組：2μL，B組：2μL，標(biāo)記各管，混勻，離心，各管對(duì)應(yīng)放入PCR儀中，注意各管蓋蓋緊，注意檢查擴(kuò)增程序是否正確，啟動(dòng)程序。DNA樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25μL，含有60 ng DNA，2.5μL dNTPs(2 mmol/L)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：37℃預(yù)變性10 min，95℃變性9 min，96℃1 min，94℃30 s，RAMP 0.4℃/s，55℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，RAMP0.2℃/s，70℃45 s，60℃延伸6 min。PCR擴(kuò)增試劑等均購(gòu)自成都博奧生物有限公司。PCRmix放置4℃解凍；臨床樣本DNA解凍，將Taq酶分別加入到A組和B組PCRmix中配置總反應(yīng)，按照A組(28μL)和B組(28μL)的體系分別分裝到0.2 mL PCR管中，將臨床DNA按順序加入到A組和B組體系中，標(biāo)記各管，混勻，離心，各管對(duì)應(yīng)放入PCR儀中，注意各管蓋蓋緊，注意檢查擴(kuò)增程序是否正確，啟動(dòng)程序。

1.2.3 雜交、洗片、讀片 PCR產(chǎn)物(A組和B組)放PCR儀中進(jìn)行95℃變性7 min，按要求放置配件，鋪好雜交膜，加入雜交液0.8 mL，預(yù)雜交45℃2 min以上，開泵，排雜交液，關(guān)泵，加入雜交液0.8 mL，將A組和B組PCR產(chǎn)物按一定順序加入到相應(yīng)反應(yīng)槽，注意每加一個(gè)立即混勻，雜交45℃，20 min，WB1液0.8 mL清洗4次，每次沖洗間隔5~10 s。洗完WB1液后再把雜交儀溫度調(diào)節(jié)為25℃，加入0.5 mL封阻液，預(yù)封阻，當(dāng)溫度降至30℃時(shí)，開泵排液，關(guān)泵，加封阻液0.5 mL，封阻5 min，開泵排液，加酶標(biāo)液0.5 mL，放置5 min，開泵排液，溶液A 0.8 mL清洗四次，清洗第二次時(shí)將溫度設(shè)定36℃，當(dāng)雜交儀溫度達(dá)到36℃時(shí)加顯色液0.5 mL，蓋好雜交儀蓋，顯色6 min，加雜交液0.8 mL，清洗三次，最后加蒸餾水清洗。最后按照凱普公司提供的標(biāo)準(zhǔn)判讀卡判讀結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，一般人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料采用統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，年齡、性別分布分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。耳聾相關(guān)基因采用(%)表示，遺傳性耳聾患者與健康對(duì)照組耳聾基因突變率比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳聾基因檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)復(fù)查210例受檢者中有188例遺傳性耳聾患兒，其中170例攜帶相關(guān)基因突變，突變率為90.43%，而健康對(duì)照組未檢測(cè)到相關(guān)基因突變，兩組基因突變率比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=170.504，P<0.01)。

2.2 170例遺傳性耳聾患兒耳聾基因檢測(cè)結(jié)果 170例攜帶相關(guān)基因突變患兒中GJB2基因突變檢出率最高，達(dá)47.65%(81/170)，以235delC突變?yōu)橹鳎蓟蛲蛔兓純旱?0.00%，其次為299delAT、176del16。SLC26A4基因突變率為37.06%(63/170)，以IVS7-2A>G突變?yōu)橹鳎蓟蛲蛔兓純?2.94%，其次為2168A>G突變，占基因突變患兒的4.12%。mtDNA 12s rRNA突變率最低，為11.18%(19/170)，以1555A>G突變?yōu)橹?，占基因突變患兒?.71%。本組共檢出特殊類型突變攜帶者7例，包括155.7445.1229.12201突變，見表1。

表1 170例遺傳性耳聾患兒耳聾基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

我國(guó)1/3殘疾人口為聽力缺失，病例數(shù)達(dá)2 780萬人，每年約3萬名聽障兒童出生，其中遺傳性耳聾占50.00%，據(jù)統(tǒng)計(jì)新生兒中耳聾發(fā)病率為1‰，約50.00%與遺傳因素相關(guān)[3]。小兒遺傳性耳聾多在2歲以后發(fā)現(xiàn)語言能力障礙后確診，使患者喪失最佳醫(yī)學(xué)干預(yù)時(shí)機(jī)，造成無法補(bǔ)救的聽力和語言功能損傷。因此早期發(fā)現(xiàn)，早期通過耳聾基因篩查確診，可最大程度避免因聾致啞，保證患兒參與基本社會(huì)生活的能力。基因檢測(cè)要求較高的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人才，在基層醫(yī)院尚未普及，大量基層單位多采取將標(biāo)本轉(zhuǎn)診至省級(jí)醫(yī)療單位或獨(dú)立的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，采血管轉(zhuǎn)運(yùn)存在低溫轉(zhuǎn)運(yùn)不便、容易破損等問題，影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。干血斑將采集適量血標(biāo)本滴在濾紙片上干燥而成，僅需采集少量標(biāo)本，常溫下可穩(wěn)妥保存且便于運(yùn)輸?shù)?，適合基層醫(yī)院基因檢測(cè)血液標(biāo)本的采集和轉(zhuǎn)運(yùn)，廣泛應(yīng)用于遺傳性耳聾的篩查。

GJB2、GJB3和SLC26A4、DNA 12SrRN等是目前與遺傳性耳聾基因研究的熱點(diǎn)，被多數(shù)國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)與耳聾的發(fā)生有關(guān)。GJB2是最常見的耳聾遺傳基因，我國(guó)語前耳聾患者中GJB2突變率為26.00%~33.00%。GJB2基因突變可引起縫隙連接蛋白Cx26功能改變，導(dǎo)致鉀離子進(jìn)入內(nèi)耳淋巴液，造成Croti螺旋器鉀中毒，淋巴液循環(huán)障礙，發(fā)生聽力障礙。我國(guó)不同地區(qū)耳聾患者GJB2突變率為4.00%~30.40%[4]。本研究顯示170例攜帶相關(guān)基因突變患兒中GJB2基因突變檢出率最高，達(dá)47.65%(81/170)，提示遺傳性耳聾患兒GJB2基因突變率最高，與多數(shù)研究報(bào)道一致。235delC是亞洲人群GJB2基因突變最常見的位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變導(dǎo)致隙連連接蛋Cx26截?cái)?，影響縫隙連接，導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾[5]。本研究檢測(cè)235delC基因突變率最高，達(dá)40.00%，高于176del16、299delT，提示235delC突變可能導(dǎo)致茂名地區(qū)遺傳性耳聾的主要耳聾基因。徐彬等[6]檢測(cè)了安徽地區(qū)漢族遺傳性耳聾兒童GJB2基因突變特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)235delC基因突變率最高。本研究未檢測(cè)到35delC基因突變，35delC突變?cè)谖覈?guó)西北回族和維吾爾族耳聾患兒中發(fā)生率較高[7]，本研究以漢族人群為主，因此較為少見，提示GJB2基因突變位點(diǎn)存在較大地區(qū)和民族差異。

SLC26A4是語前耳聾患者基因突變率僅次于GJB2突變基因，SLC26A4基因突變具有明顯種族差 異 性，T416P、L236P、2168A>G、IVS7-2A>G是SLC26A4基因常見突變類型，其中歐洲人SLC26A4基因突變類型以T416P和L236P為主，日本和韓國(guó)人以2168A>G為主，中國(guó)臺(tái)灣以IVS7-2A>G突變常見。IVS7-2A>G基因突變可使第8號(hào)外顯子功能障礙，影響氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)，引起大前庭導(dǎo)水管綜合征，導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾，但是具體機(jī)制尚不清楚。中國(guó)漢人SLC26A4基因突變類型IVS7-2A>G和2168A>G檢出率最高分別達(dá)44.11%和11.60%[8]。本研究觀察茂名地區(qū)遺傳性耳聾患兒SLC26A4基因突變率37.06%(63/170)，僅次于GJB2，IVS7-2A>G純合突變率最高，本組攜帶SLC26A4基因突變患兒中例出現(xiàn)大前庭導(dǎo)水管綜合征，與臨床診斷符合，提示檢測(cè)SLC26A4基因有助于遺傳性耳聾的診斷。

線粒體DNA 12srRNA基因是與氨基糖苷類藥物性耳聾及非綜合征耳聾有關(guān)的母系遺傳基因，1555A>G、1494C>T是mtDNA 12s rRNA較為常見的突變位點(diǎn)。國(guó)內(nèi)報(bào)道1555A>G突變陽性率為1.00%~3.00%[9]，本研究中1555A>G是mtDNA 12s rRNA檢出率最高的突變基因位點(diǎn)，但其突變檢出率較低，僅4.71%，低于我國(guó)西北地區(qū)經(jīng)濟(jì)條件相對(duì)落后地區(qū)[10]。分析原因可能是近年來臨床對(duì)兒童用藥安全性意識(shí)提高，規(guī)范氨基糖苷類藥物的應(yīng)用，嚴(yán)格限制兒童使用氨基糖苷類藥物，避免其接觸此類耳毒性藥物大大減少了耳聾發(fā)生率。1494C>T突變檢出率0.59%，提示1494C>T不是茂名地區(qū)遺傳性耳聾的熱點(diǎn)突變。GJB3也是遺傳性耳聾相關(guān)基因，其突變可導(dǎo)致縫隙連接蛋白Cx31功能喪失，導(dǎo)致內(nèi)淋巴液鉀離子循環(huán)障礙，影響內(nèi)耳毛細(xì)胞功能而致聾。本研究未檢測(cè)到GJB3基因突變，詹悅等[11]檢測(cè)了湖北地區(qū)306例極重度耳聾患兒耳聾相關(guān)基因變異情況，也未發(fā)現(xiàn)GJB3基因突變，提示GJB3也不是茂名地區(qū)遺傳性耳聾的熱點(diǎn)突變。

綜上所述，本研究通過茂名地區(qū)170例遺傳性耳聾患兒采用干血斑基因檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)耳聾相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)GJB2、SLC26A4、mtDNA 12s rRNA基因突變可能是茂名地區(qū)遺傳性耳聾患兒主要致聾基因，235delC、IVS7-2A>G、1555A>G是本組遺傳性耳聾最常見的基因突變類型。由于本研究納入樣本例數(shù)較少，因此茂名地區(qū)遺傳性耳聾兒童耳聾基因突變特點(diǎn)仍需繼續(xù)擴(kuò)大樣本加以證實(shí)。