方紅

肺癌(lung cancer)根據(jù)病理類型分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌約占全部肺癌患者的80%左右[1-2]。新近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，肺癌在男性發(fā)病率和死亡率均占到了第一位，在女性死亡率占到第一位而發(fā)病率僅次于乳腺癌占第二位[3]。肺癌患者預(yù)后不良，容易早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。然而肺癌的確切發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，目前的研究結(jié)果認(rèn)為其發(fā)病與吸煙、環(huán)境和遺傳等因素有關(guān)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、基因表達(dá)譜芯片及二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大規(guī)模、高通量在基因分子水平上探討肺癌發(fā)病機(jī)制成為可能[4]。同時(shí)也為肺癌的治療提供了新的方向[5]。在本研究中，我們采用生物技術(shù)方法探討細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2A在NSCLC中的差異表達(dá)、可能生物學(xué)功能及與患者的預(yù)后關(guān)系。

資料與方法

一、相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇

選擇癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA)比較NSCLC患者癌組織、正常肺組織的差異表達(dá)水平及其與患者預(yù)后關(guān)系；采用蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)STRING進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。David數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能富集和KEGG信號(hào)通路分析。

二、CDKN2A差異表達(dá)、功能富集和信號(hào)通路分析

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“非小細(xì)胞肺癌”和“CDKN2A基因”檢索物種為人類，分析比較CDKN2A基因表達(dá)水平在NSCLC患者癌組織和正常肺組織中是否存在差異。同時(shí)分析了TRIM26基因在多種人體腫瘤中的表達(dá)水平，存在差異的條件為基因|Log2FC|>1，P<0.05。CDKN2A基因及相互作用蛋白進(jìn)行功能富集和信號(hào)通路分析。功能包括，細(xì)胞定位、分子功能和生物學(xué)過程。

三、 蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

CDKN2A基因編碼蛋白進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，STRING (http://string-db.org/cgi/input.pl)[6]，相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為置信度大于0.7。

四、預(yù)后分析

CDKN2A基因高低表達(dá)按NSCLC患者腫瘤組織中位數(shù)進(jìn)行劃分，并繪制高低表達(dá)組Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，對(duì)比總生存和無疾病進(jìn)展生存有無差異。

五、免疫組化檢測(cè)CDKN2A表達(dá)

回顧性分析我院近5年收治并手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者62例為研究對(duì)象。62例患者中男性41例，女性21例，平均年齡68.8±11.2歲，其中腺癌34例，鱗癌28例。采用免疫組化SP法檢測(cè)患者腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中CDKN2A的表達(dá)水平。比較癌組織和癌旁組織中CDKN2A表達(dá)水平是否存在差異。同時(shí)采用log-ran檢驗(yàn)比較CDKN2A陽(yáng)性和陰性表達(dá)組患者生存期是否存在差異。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

相關(guān)聚類、差異表達(dá)、蛋白網(wǎng)路等采用在線軟件分析，生存數(shù)據(jù)采用log-rank檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、CDKN2A在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

CDKN2A基因在多種實(shí)體腫瘤包括乳腺癌、食管癌、腸癌等中表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖1A)。在NSCLC患者(包括腺癌和鱗癌)癌組織中CDKN2A表達(dá)水平均明顯高于對(duì)應(yīng)的正常肺組織(pall<0.05)，圖1B。而CDKN2A表達(dá)水平與腫瘤分期無明顯相關(guān)性，P>0.05(圖1C)。

圖1 細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2a(CDKN2A)在腫瘤組織與正常組織中的表達(dá)比較

A: CDKN2A在多種腫瘤中的表達(dá)比較，紅色為腫瘤組織，藍(lán)色為癌旁組織； B:NSCLC患者(包括鱗癌和腺癌)癌組織與對(duì)應(yīng)的癌旁組織中CDKN2A表達(dá)比較，紅色為腫瘤組織，綠色為癌旁組織；C: CDKN2A與NSCLC患者分期關(guān)系

二、CDKN2A相關(guān)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

CDKN2A相關(guān)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)中(圖2)，蛋白之間的相互作用關(guān)系指數(shù)為24.8，區(qū)域聚類指數(shù)為0.74，相互作用蛋白呈現(xiàn)明顯的聚類表達(dá)，P<0.05(見圖3)。

圖2 CDKN2A相關(guān)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 CDKN2A相關(guān)蛋白聚類分析熱圖

三、GO和KEGG功能富集和信號(hào)通路分析

CDKN2A編碼蛋白主要定位在細(xì)胞核、細(xì)胞膜和囊泡，分子功能主要為蛋白結(jié)合、核蛋白結(jié)合和鐵結(jié)合。而生物學(xué)過程主要集中于代謝、細(xì)胞增殖及對(duì)刺激的反應(yīng)(圖4)。KEGG信號(hào)通路主要為細(xì)胞周期調(diào)控、DNA蛋白結(jié)合以及Wnt信號(hào)通路。

圖4 CDKN2A基因功能富集

四、 生存分析

CDKN2A高表達(dá)NSCLC患者總生存期明顯低于低表達(dá)組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=1.3,P=0.02)，而CDKN2A高低表達(dá)組間，NSCLC患者無疾病進(jìn)展生存無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(HR=0.94,P=0.59)(圖5)。

圖5 CDKN2A高低表達(dá)組與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系的生存曲線(A:NSCLC患者總生存比較；B:NSCLC患者無疾進(jìn)展生存比較)

五、免疫組化CDKN2A表達(dá)及其與患者預(yù)后

62例NSCLC患者癌組織中CDKN2A陽(yáng)性表達(dá)11例(17.7)而對(duì)應(yīng)癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)49例(79.0%)，癌組織中CDKN2A陽(yáng)性標(biāo)的率顯著高于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而CDKN2A陽(yáng)性組與陰性組患者生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.99,P>0.05)(圖6)。

圖6 CDKN2A陽(yáng)性組與陰性組患者生存曲線

討 論

細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2A(CDKN2A)或P16INK4A，在人類定位于9號(hào)染色體，21區(qū)[7-8]。該基因全場(chǎng)8500bp，包括3個(gè)外顯子，編碼一個(gè)由148個(gè)氨基酸組成的蛋白。該基因首先在上世紀(jì)90年代初由Serrano發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究中認(rèn)為其可與CDK4、CDK6結(jié)合，抑制周期素與CDK4形成具激酶活性的復(fù)合物，從而阻斷該復(fù)合物對(duì)RB蛋白磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞停止于G，從而抑制了細(xì)胞的增殖，是一個(gè)細(xì)胞周期依賴的蛋白。1994年(美國(guó)冷泉港實(shí)室)新發(fā)現(xiàn)CDKN2A是一種細(xì)胞周期中的基本基因，直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，負(fù)有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂，在人類50%腫瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)有純合子缺失，認(rèn)為p16是比p53更重要的一種新型抗癌基因有人把它比作細(xì)胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，導(dǎo)致惡性腫瘤。

后續(xù)研究逐漸發(fā)現(xiàn)，CNKN2A基因在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)，在腫瘤患者癌組織中表達(dá)水平往往上調(diào)，并與患者的臨床病理特征和預(yù)后存在一定的相關(guān)性。如楊軍[9]等人研究發(fā)現(xiàn)CDKN2A在膀胱癌患者癌組織中異常表達(dá)并膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。王勇文等人[10]研究顯示CDKN2A基因的變異及其編碼蛋白質(zhì)的失活與小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。而CDKN2A在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的研究及其功能相對(duì)報(bào)道較少，CDKN2A高低表達(dá)與NSCLC患者的預(yù)后關(guān)系也并不明確。因此。我們采用生物技術(shù)方法探討細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2A在NSCLC中的差異表達(dá)、可能生物學(xué)功能及與患者的預(yù)后關(guān)系，以期待為臨床治療NSCLC提供新的思路和靶向藥物研發(fā)方向。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CDKN2A基因在多種實(shí)體腫瘤包括乳腺癌、食管癌、腸癌等中表達(dá)水平明顯上調(diào)。CDKN2A的常高表達(dá)可能與多種人體腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括NSCLC。而CDKN2A相關(guān)的信號(hào)通路也大多集中于細(xì)胞周期分裂和細(xì)胞增殖，再次證明CDKN2A參與了細(xì)胞的周期調(diào)控，可能成為抑制腫瘤分裂癥狀的重要靶點(diǎn)。同時(shí)我們研究證明，CDKN2A的高表達(dá)與NSCLC患者的預(yù)后不良有關(guān)，有望成為NSCLC預(yù)后的分子標(biāo)志物。但研究?jī)H從生物信息層面進(jìn)行了證實(shí)，后續(xù)仍需要相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。