李俊磊，張紅兵

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061)

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人口增長(zhǎng)，人們對(duì)能源的依賴(lài)日趨加劇，但石油、天然氣等石化能源燃燒會(huì)產(chǎn)生大量的CO2，加速溫室效應(yīng)，產(chǎn)生的NO2、SO2和PM 2.5會(huì)造成大氣污染，成為亟待解決的問(wèn)題。以生物油脂為原料生產(chǎn)的生物柴油(脂肪酸甲酯)含硫低、潤(rùn)滑好、易燃燒，有替代傳統(tǒng)柴油的潛力，成為近年來(lái)生物能源研發(fā)的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)能源作物大豆、玉米、油菜、麻風(fēng)樹(shù)等相比，微藻生長(zhǎng)速率快、適應(yīng)性強(qiáng)、不占用耕地，可與廢氣廢水治理相結(jié)合，是理想的生物能源制備原料。

微藻的油脂含量是影響終產(chǎn)品成本的關(guān)鍵因素之一，目前微藻型生物柴油的價(jià)格較高，難以推動(dòng)其商業(yè)化應(yīng)用。隨著人們對(duì)微藻脂質(zhì)合成與代謝途徑研究的不斷深入，從現(xiàn)有微藻出發(fā)，利用基因工程方法對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行改造，增加微藻脂質(zhì)積累水平，相比傳統(tǒng)的微藻培養(yǎng)優(yōu)化無(wú)疑是一條捷徑。本文從微藻脂質(zhì)的合成途徑出發(fā)，綜述了國(guó)內(nèi)外利用基因工程技術(shù)改造微藻，提高脂質(zhì)積累的方法，并對(duì)應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 TAG的合成途徑

TAG是微藻中組成中性脂質(zhì)的主要成分，在藻細(xì)胞處于靜止生長(zhǎng)期或壓力條件下容易積累。TAG在酸、堿或酶等存在的條件下，可以與甲醇進(jìn)行酯交換生成生物柴油和甘油。微藻內(nèi)TAG的合成可分為葉綠體內(nèi)脂肪酸合成途徑、游離脂肪酸跨膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Kennedy途徑和包裝油脂小滴四個(gè)階段。其中脂肪酸合成途徑和Kennedy途徑是TAG合成的關(guān)鍵，調(diào)控這兩個(gè)途徑是提高微藻脂質(zhì)積累的突破口。

1.1 脂肪酸合成途徑

1.2 Kennedy途徑

脂酰輔酶A(acyl-CoA)和3-磷酸甘油(G3P)是Kennedy途徑的直接前體，acyl-CoA由穿過(guò)葉綠體膜的FFA經(jīng)脂肪酸硫激酶催化形成，G3P由磷酸二羥基丙酮(DHAP)經(jīng)3-磷酸甘油脫氫酶(G3PDH)催化產(chǎn)生。甘油三磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)催化acyl-CoA的脂酰基轉(zhuǎn)移到G3P的sn-1位，酯化生成溶血磷脂酸(LPA)。溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)繼續(xù)催化LPA的sn-2位酯化生成磷脂酸(PA)。PA在磷脂酸磷酸酶(PAP)的作用下脫去磷酸形成二酰甘油(DAG)。最后DAG在二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)作用下sn-3位酯化形成TAG。

2 基因工程方法增加微藻脂質(zhì)積累

生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)微藻與植物的脂質(zhì)合成過(guò)程高度相似，可借鑒現(xiàn)有高等植物對(duì)TAG合成的研究結(jié)果，利用基因工程方法從增強(qiáng)脂肪酸合成、增強(qiáng)Kennedy途徑和抑制脂肪的合成競(jìng)爭(zhēng)三類(lèi)途徑提高微藻脂質(zhì)的積累。

2.1 增強(qiáng)脂肪酸合成途徑

脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶主要包括PDH、ACCase、FAS、碳酸酐酶(CA)。

PDH的活性與TAG的積累具有很強(qiáng)的相關(guān)性，并受丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)負(fù)調(diào)控，Ma等[1]通過(guò)RNA干擾敲低了微藻內(nèi)的PDK基因(NsPDK)，使碳通量轉(zhuǎn)向TAG積累，且改造后的基因工程藻細(xì)胞不受高光抑制。

ACCase抑制劑的存在會(huì)導(dǎo)致TAG累積水平顯著下降，但研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ACCase卻不能提高微藻脂質(zhì)積累，推測(cè)可能是受到了反饋抑制，其后續(xù)的研究不多[2-3]。

FAS催化脂肪酸碳鏈的加長(zhǎng)，但目前尚未見(jiàn)到成功高表達(dá)FAS的報(bào)道。

2.2 增強(qiáng)Kennedy途徑

相對(duì)于脂肪酸合成途徑，Kennedy途徑相對(duì)更靠近目標(biāo)產(chǎn)物，因此更容易影響TAG的合成。與Kennedy途徑相關(guān)的限速酶主要包括：GPAT、LPAAT、PAP、DGAT、G3PDH。

Niu等[6]在三角褐指藻中過(guò)表達(dá)GPAT基因，經(jīng)尼羅紅熒光染色發(fā)現(xiàn)其中性脂質(zhì)含量增加了2倍，GC-MS分析顯示不飽和脂肪酸比例與野生型相比顯著提高，更有利于生產(chǎn)生物柴油。Balamurugan等[7]發(fā)現(xiàn)AGPAT1的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)富油新綠藻中參與TAG合成的其他關(guān)鍵基因如DGAT2和GPAT的表達(dá)，使TAG含量增加1.81倍，同時(shí)多不飽和脂肪酸中的EPA和DHA顯著增加，而總碳水化合物和可溶性蛋白質(zhì)含量低。

LPAAT是Kennedy途徑的第二個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶，Chungjatupornchai等[8]將萊茵衣藻的NeoLPAAT1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)至原始藻株的2倍，使TAG含量增加2.1～2.2倍，產(chǎn)率增加1.9～2.8倍。Wang等提出了一種結(jié)合遺傳操作與間歇性熱休克結(jié)合的新策略，將其它藻源的c-LPAAT和c-GPD1插入到萊茵衣藻的DNA中，3次熱休克后c-LPAAT和c-GPD1的轉(zhuǎn)錄水平增加了5.3和8.6倍，脂質(zhì)含量分別增加44.5%和67.5%。

PAP催化PA的去磷酸化，形成DAG和無(wú)機(jī)正磷酸鹽，該反應(yīng)在TAG的合成中是不可或缺的。Deng等[9]發(fā)現(xiàn)三角褐指藻中CrPAP2的mRNA水平比無(wú)氮培養(yǎng)條件時(shí)高，使用RNA干擾方法沉默CrPAP2基因后可導(dǎo)致脂質(zhì)含量下降2.4%～17.4%，而過(guò)表達(dá)CrPAP2基因則導(dǎo)致脂質(zhì)含量增加7.5%～21.8%，證明CRPAP2具有影響脂質(zhì)合成的潛力。

DGAT是催化TAG生物合成最后步驟的關(guān)鍵酶。為了增加TAG含量，Klaitong等[10]在富油新綠藻中過(guò)表達(dá)NeoDGAT2，使其轉(zhuǎn)錄水平提高2倍，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)積累加速，轉(zhuǎn)化后TAG含量增加1.8～3.2倍，產(chǎn)率提高1.6～4.3倍。Niu[11]在三角褐指藻中過(guò)表達(dá)DGAT2后中性脂質(zhì)含量增加了35%，多不飽和脂肪酸比例顯著增加，且生長(zhǎng)速率保持在較高水平，與Li等[12]的報(bào)告相似。

除了過(guò)表達(dá)單個(gè)或數(shù)個(gè)靶基因，Zou等[13]嘗試在三角褐指藻中引入高效的組成型啟動(dòng)子Pt211來(lái)增加多個(gè)靶基因的表達(dá)水平。QPCR分析表明參與TAG生物合成的GUS、GPAT和DGAT2等基因在Pt211驅(qū)動(dòng)下顯示更高的轉(zhuǎn)錄豐度，并且不影響藻類(lèi)的生長(zhǎng)和光合作用。

2.3 抑制脂肪合成的競(jìng)爭(zhēng)途徑

淀粉合成途徑會(huì)與Kennedy途徑競(jìng)爭(zhēng)共同前體G3P，抑制脂肪合成的競(jìng)爭(zhēng)途徑，改變碳分配方向，也能夠提高微藻脂質(zhì)積累水平。研究表明，萊茵衣藻的CONSTANS基因具有調(diào)節(jié)淀粉含量的作用，Deng等[14]敲低CONSTANS基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TAG生物合成相關(guān)基因(DGAT2、PAP2和PDAT3)的表達(dá)水平提高，使TAG含量增加24.5%。

微綠球藻是一種高產(chǎn)油的藻種，Ajjawi等[15]用RNA-seq分析在氮?jiǎng)儕Z期間作為脂質(zhì)合成負(fù)調(diào)節(jié)劑的多種轉(zhuǎn)錄因子，利用CRISPR-Cas9敲除真菌 Zn(II)2Cys6 編碼基因的同源物，發(fā)現(xiàn)能夠改善微藻在營(yíng)養(yǎng)充足條件下總碳與脂質(zhì)的分配，雖然突變體生長(zhǎng)不良，但產(chǎn)生的脂質(zhì)卻是野生型的2倍。

3 總結(jié)與展望

微藻在非脅迫條件下進(jìn)行碳捕獲，合成和儲(chǔ)存淀粉以支持生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂，只有在脅迫條件下傾向于以生長(zhǎng)為代價(jià)積累大量的儲(chǔ)存脂質(zhì)，因此有必要對(duì)微藻TAG的生物合成途徑和代謝調(diào)控進(jìn)行深入的研究，在保持高生長(zhǎng)速度的同時(shí)增加脂質(zhì)積累，這對(duì)于生物柴油的生產(chǎn)是至關(guān)重要的。已有的研究成果表明，增強(qiáng)脂肪酸合成途徑、增強(qiáng)Kennedy途徑和抑制脂肪合成的競(jìng)爭(zhēng)途徑都能夠影響TAG的合成。

與此同時(shí)，也要考慮基因工程微藻對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，在將新型突變菌株作為工業(yè)用途之前，必需通過(guò)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，防止具有優(yōu)勢(shì)的轉(zhuǎn)基因微藻如果借助開(kāi)放的水域中逃逸到外部環(huán)境，打破原有的生態(tài)平衡。

雖然基因工程手段增加微藻油脂積累的相關(guān)研究才剛剛起步，但鑒于其針對(duì)性強(qiáng)、效率高、潛在的經(jīng)濟(jì)效益突出，其科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值明顯，成為越來(lái)越多的研究人員的關(guān)注焦點(diǎn)和研究熱點(diǎn)，隨著新發(fā)現(xiàn)和新成果的不斷涌出，微藻產(chǎn)油的商業(yè)化應(yīng)用必定會(huì)實(shí)現(xiàn)。