賀大芳，邱文英，陳奕帆，鄒 瑤，王 德

（華派生物工程集團有限公司，四川 簡陽 641402）

豬塞內(nèi)卡病毒A（Senecavirus A,SVA）易感染動物。豬是該病毒的重要傳染源，能通過多種途徑排出病毒，如唾液、糞便、水皰皮等，在康復(fù)的動物組織中也能檢測到該病毒核糖核酸[1]。SVA可引起豬出現(xiàn)水皰性變化和新生仔豬死亡，成年豬通常呈亞臨床感染，引起繁殖母豬和公豬鼻吻和冠狀帶、蹄部出現(xiàn)水皰樣病變，偶見腹瀉癥狀[2]。SVA易感動物較廣泛，不僅不同年齡豬均易感[3]，研究者還在其他動物如人、蒼蠅[4]、牛和鼠等的血清中發(fā)現(xiàn)了SVA中和抗體，表明SVA能感染的動物種類可能較多。SVA能適應(yīng)不同的細胞系，可利用豬睪丸細胞（SK-RST）、豬腎細胞（PK-15）和幼倉鼠腎細胞（BHK-21）[5]、人肺癌細胞（NCI-H1299）[6]等對SVA進行分離。

SVA是小RNA病毒，是塞內(nèi)卡病毒屬（Senecavirus）的唯一成員[7]。它的基因組全長為7.2 kb，包括5'非編碼區(qū)、一個開放閱讀框及3'非編碼區(qū)，其功能如同mRNA，編碼病毒聚蛋白。SVA顆粒呈典型的二十面體對稱，直徑27 nm左右，外表面點綴著VP1、VP2和VP3伸出的肽環(huán)，且VP1和VP3是主要的抗原表位[8]。其中，VP1是能夠顯著誘導(dǎo)細胞發(fā)生早期和晚期凋亡，并且能夠促進凋亡蛋白Caspase3、Caspase8及Bax蛋白和mRNA水平的上調(diào)[9]，且VP1核苷酸易發(fā)生變異[10]，是抗原變異的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，因此VP1是重要的抗原位點。

因此，本研究以SVAVP1基因為目的片段構(gòu)建的原核表達載體在大腸桿菌中進行了誘導(dǎo)表達，并經(jīng)過純化獲得較高純度的蛋白，為后續(xù)SVAVP1蛋白免疫原性的研究及塞內(nèi)卡病毒病抗體ELISA方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SVAVP1基因序列[參考GenBank中收錄的SVA-001（DQ641257）的基因組序列VP1基因]，大小為788 bp，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成；pET-28a（+）載體由本實驗室（華派生物工程集團質(zhì)檢研發(fā)中心）保存；SVA高免血清由本實驗室自制。

1.2 主要試劑

E.coli DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶Bam HI和Xho I購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq Mix、質(zhì)粒小提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；HRP標記的山羊抗豬IgG抗體購自KPL公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 VP1基因的擴增 參考GenBank中收錄的SVA-001（DQ641257）的基因組序列的VP1基因合成的序列為目的片段，并以此序列片段為模板設(shè)計1對引物，正向引物加入Bam HI酶切位點，F(xiàn):5'-CGCGGATCC TACCGTGAAACTCGGGCTATTACCA-3'；反向引物加入Xho I酶切位點R:5'-CCGCTCGAGAAGCTTGGAA GCGCCCCCCCA-3'，加下劃線部分即為引入的酶切序列，引物的合成由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。以合成的VP1基因序列為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：2×Taq Mix 12.5μL，dNTPMix 1.0μL，上下游引物各1.0μL，模板2.0μL，ddH2O補足至25μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃5min，（94℃30 s，53℃45 s，72℃1min）35個循環(huán)，72℃10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用膠回收試劑盒將VP1基因擴增片段純化回收，利用Bam HI和Xho I進行雙酶切，同時用Bam HI和Xho I雙酶切pET-28a（+）載體，酶切結(jié)束電泳后切膠回收。兩種酶切產(chǎn)物按照適宜比例，利用T4連接酶在16℃過夜連接，連接產(chǎn)物經(jīng)熱擊法轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素的平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落進行菌落PCR鑒定。鑒定呈陽性的菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后，質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，再進行Bam HI和Xho I雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序驗證，測序驗證正確的重組質(zhì)粒命名pET-28a（+）-VP1。

1.3.3 重組質(zhì)粒pET-28a（+）-VP1的誘導(dǎo)表達 取成功構(gòu)建的pET-28a（+）-VP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。分別挑取3～5個單菌落于含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)12～16 h，以此為種子液。種子液按照體積比1∶100轉(zhuǎn)接到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，當菌液的D600值在0.8～1.0時，加入終濃度為1 mmoL/L的IPTG，在37℃、180 r/min進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)后菌液經(jīng)4℃、5 000 r/min離心收集菌體。菌體用PBS緩沖液重懸后冰浴超聲破碎，裂解液進行離心后分別收集上清和沉淀，對其進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，上樣量為15μL，考馬斯亮藍染色后分析重組VP1蛋白表達情況。

1.3.4 重組VP1蛋白的純化及復(fù)性 經(jīng)小量表達驗證成功的克隆，擴大培養(yǎng)后進行大量誘導(dǎo)，收集大量誘導(dǎo)表達菌體后，用PBS緩沖液重懸，冰浴超聲破碎，離心收集包涵體沉淀。包涵體沉淀經(jīng)包涵體洗滌液洗滌后用8M尿素溶解，再4℃、12 000 r/min離心25 min。上清液移至處理后的透析袋中，依次經(jīng)6M、4M、2M、1M、0.5M、0.2M尿素透析復(fù)性。純化的每個步驟后都進行SDS-PAGE電泳，分析純化后重組蛋白的純度和表達量。

1.3.5 純化后VP1蛋白Western blot鑒定 取純化復(fù)性后的VP1蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含50 g/L脫脂奶粉溶液的PBST常溫封閉2 h；加入SVA高免血清（1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗滌3次后加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1∶50 000稀釋），室溫孵育2 h；TBST洗滌3次后ECL顯影。

2 結(jié)果

2.1 VP1基因的PCR擴增

經(jīng)PCR法擴增出788 bp的VP1基因序列，擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期相符（圖1），表明本研究成功克隆到SVAVP1基因。

2.2 原核表達載體的構(gòu)建與驗證

將VP1的PCR產(chǎn)物和載體pET-28a（+）分別用限制性內(nèi)切酶Bam HI和Xho I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接，熱擊轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中。挑取菌落PCR驗證為陽性的單菌落（圖2），提取的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗證（圖3）后送生物公司經(jīng)載體pET-28a（+）的T7-Terminal引物測序。測序結(jié)果表明該序列與GenBank中收錄的SVA-001（DQ641257）的基因組序列的VP1基因序列的相似性為100%，且編碼框插入正確。

2.3 重組VP1基因的原核表達及可溶性分析

利用鑒定為陽性的BL21（DE3）/pET-28a（+）-VP1原核表達菌株進行原核誘導(dǎo)表達，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，37℃下誘導(dǎo)表達6 h。菌體經(jīng)過離心重懸，超聲破碎后進行SDS-PAGE電泳。結(jié)果（圖4）：BL21（DE3）/pET-28a（+）-VP1菌成功表達出預(yù)期36 kDa大小的特異性蛋白條帶，且超聲裂解后菌液及離心后的上清液和沉淀的電泳結(jié)果表明，表達的VP1蛋白主要以包涵體形式存在。

2.4 VP1蛋白的純化

將超聲波裂解后的菌液沉淀用包涵體洗滌液洗滌3次后，用8M尿素溶解可得到純度較高的VP1蛋白（圖5）。再依次經(jīng)6M、4M、2M、1M、0.5M、0.2M尿素進行透析復(fù)性，得到純度為80%以上、濃度為400μg/mL的VP1蛋白。

2.5 純化后VP1蛋白Western blot分析

Western blot檢測結(jié)果表明，純化后的VP1蛋白可與SVA高免血清發(fā)生特異性結(jié)合，出現(xiàn)一條大小與SDS-PAGE中VP1蛋白一致的條帶（圖6），表明該條帶為VP1蛋白。

3 討論

近幾十年來關(guān)于SVA大量研究發(fā)現(xiàn)，SVA已發(fā)生變異，致病性逐漸增強[11]。并且VP1基因也表現(xiàn)出明顯差異，但這些變異是不是導(dǎo)致毒株致病性增強的原因還有待研究。有研究表明，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的抗原具有構(gòu)象依賴性[12]，因此VP1蛋白空間構(gòu)象與其功能有著重要聯(lián)系。作為SVA最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，VP1蛋白在病毒感染和自然免疫中都發(fā)揮著重要作用[13]，故而獲得有活性的高質(zhì)量的VP1蛋白對于進一步研究SVA診斷及其防治顯得尤為重要。

大腸桿菌表達系統(tǒng)能表達外源蛋白，具有方法簡單、蛋白表達量高、蛋白易純化、成本低等優(yōu)點，胰島素等生物制品都能在大腸桿菌中表達，其中以BL21（DE3）為應(yīng)用最廣泛的表達宿主。pET系列的載體采用噬菌體T7啟動子，目的基因克隆到載體上，可以實現(xiàn)目的基因的高效表達，但目標蛋白主要以包涵體形式表達[14]。包涵體是沒有生物活性的蛋白，是蛋白表達過程中肽鏈部分折疊的中間體聚合形成的，其復(fù)性效率較低，除了與復(fù)性過程性質(zhì)相關(guān)外，還與蛋白質(zhì)本身特性有關(guān)。

目前關(guān)于SVA的研究主要是流行病學、臨床癥狀和病原學等方面，其診斷技術(shù)主要集中在病原學診斷和血清學診斷，其防治技術(shù)仍處于探索階段。因此，本試驗起以pET-28a（+）為表達載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a（+）-VP1并于原核表達系統(tǒng)BL21（DE3）表達了重組蛋白，以為后續(xù)VP1蛋白的功能研究、SVA診斷方法研究以及疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，VP1蛋白主要以包涵體的形式進行表達，與各文獻報道一致。本試驗經(jīng)洗滌，尿素溶解及復(fù)性過程得到了高純度的VP1蛋白，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。