陳云霞，蘇俊平，劉海勇，陳雪，馬瑩

下肢血管病變(lower limb peripheral arterial disease，LLPAD)是外周動(dòng)脈疾病的主要表現(xiàn)，2型糖尿病是LLPAD的既定危險(xiǎn)因素，2型糖尿病患者LLPAD預(yù)后差，進(jìn)展快，血管系統(tǒng)病變范圍更廣，更易形成狹窄和閉塞[1]。2型糖尿病的末梢神經(jīng)病變導(dǎo)致患者疼痛感喪失和間歇性跛行的頻率降低，即使并發(fā)LLPAD，也難被發(fā)現(xiàn)，直到病情加重進(jìn)展，表現(xiàn)為潰瘍或壞疽等LLPAD末期癥狀，最終被迫截肢[2]。微小RNA(miRNA)是一組微小的非編碼單鏈RNA，通過翻譯后mRNA切割或降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。miR-27在礦物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)(磷酸鈣穩(wěn)態(tài))中起重要作用，促進(jìn)血清Ca2+水平升高。研究表明，miR-27通過其對血管鈣化和內(nèi)皮功能障礙的影響誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。最近，臨床研究提供了支持循環(huán)miR-27水平升高與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病之間關(guān)系的證據(jù)[4-5]。多項(xiàng)研究表明，血清miR-27水平不僅與亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，而且與冠狀動(dòng)脈疾病有關(guān)，表明miR-27參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[6]。而關(guān)于miR-27與老年2型糖尿病下肢血管病變的研究較少。25-羥維生素D3[25(OH)D3]與骨代謝密切相關(guān)?，F(xiàn)分析血清miR-27與老年2型糖尿病下肢血管病變及25(OH)D3水平的關(guān)系，為老年2型糖尿病下肢血管病變的治療提供依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月—2019年5月河北省滄州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科確診老年2型糖尿病患者86例為T2DM組，符合中國2型糖尿病防治指南(2013年版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，男45例，女41例，年齡60～87(74.85±13.85)歲；病程4～14(9.65±5.41)年；吸煙40例，飲酒35例 。根據(jù)是否發(fā)生下肢血管病變，分為下肢血管病變(LLPAD)亞組44例和非下肢血管病變(Non-LLPAD) 亞組42例。選擇同期醫(yī)院門診健康體檢者76例為對照組，對照組無糖尿病或高血壓家族史，血壓、血脂正常。2組性別、年齡、基礎(chǔ)病、合并癥、BMI、吸煙、飲酒情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過,所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

表1 對照組、T2DM組臨床資料比較

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲，病程均>6個(gè)月；②穩(wěn)定的血糖降低方案至少3個(gè)月；③過去6個(gè)月內(nèi)無創(chuàng)傷或手術(shù)；④無嚴(yán)重的心腦肝腎疾??；⑤代謝穩(wěn)定至少6個(gè)月；⑥在過去1個(gè)月內(nèi)使用血管超聲，下肢血管造影或磁共振成像診斷下肢外周血管疾病，踝臂指數(shù)(ankle/brachial index，ABI)<0.9。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①1型糖尿病，妊娠糖尿病或其他特定類型的糖尿?。虎诟文I功能不全；③甲狀腺功能減退癥，急性感染，惡性腫瘤或精神疾病。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 miR-27表達(dá)水平檢測：抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血5 ml置于普通采血管中，5 000 r/min 離心5 min，分離血清。采用Trizol Reagent試劑(美國Invitrogen公司)從血清中提取總RNA；BioPhotometer Plus核酸蛋白定量檢測儀(美國賽默飛世爾公司)分析總RNA濃度；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。PCR引物的序列如下，miR-27正向引物5'-CTTGATCGCAAGGGTTGAGTCT-3'，反向引物5'-TTGTGTACGTGAGGTGCAGACTGATGC-3'。U6正向引物5'-CCTGTGTGACTGGCTTGTGTGATGC-3'；反向引物5'-TGAGTGCTGACACGAACCTGTGAGT -3'。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 30 s、變性 95℃ 5 s、60℃ 44 s，40個(gè)循環(huán)，61℃時(shí)采集熒光，用FX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)檢測其表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果分析，以U6作為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算miR-27相對表達(dá)水平。

1.3.2 血清25(OH)D3測定：抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血5 ml置于普通采血管中，5 000 r/min 離心5 min，分離血清。采用25(OH)D3試劑盒(德國羅氏診斷有限公司)于美國貝克曼AU-580全自動(dòng)生化分析儀測定血清25(OH)D3。

1.3.3 血生化指標(biāo)檢測：抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血5 ml置于普通采血管中，5 000 r/min 離心5 min，分離血清，以美國貝克曼AU-580全自動(dòng)生化分析儀測定空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；美國伯樂680酶標(biāo)儀測定高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)；Coatron1800全自動(dòng)凝血分析儀(德國美創(chuàng)公司)測定纖維蛋白原(Fib)。

1.3.4 LLPAD判定：以德國西門子 Acuson SequoiaC512 型彩色多普勒超聲診斷儀檢測患者足背動(dòng)脈、脛后動(dòng)脈、脛前動(dòng)脈、腘動(dòng)脈、股動(dòng)脈內(nèi)徑、斑塊大小及狹窄度；動(dòng)脈內(nèi)膜增厚(≥1 mm)，單發(fā)、多發(fā)、彌漫性斑塊及狹窄(>30%)均為LLPAD。

2 結(jié) 果

2.1 各組相關(guān)指標(biāo)比較 與對照組比較，T2DM組miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平升高(P<0.01)，25(OH)D3、HDL-C水平降低(P<0.01)；與Non-LLPAD亞組比較，LLPAD亞組miR-27 mRNA、TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG水平升高(P<0.01)，25(OH)D3、HDL-C水平降低(P<0.01)，見表2。

2.2 miR-27 mRNA與各指標(biāo)的相關(guān)性分析 miR-27 mRNA與25(OH)D3、HDL-C呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與TC、TG、LDL-C、Fib、HbA1c、hs-CRP、FPG呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表2 各組相關(guān)指標(biāo)比較

表3 miR-27 mRNA與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 老年2型糖尿病合并下肢血管病變發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 高水平的miR-27 mRNA、TC及低水平的25(OH)D3均為老年2型糖尿病合并下肢血管病變發(fā)生的危險(xiǎn)因素(OR=2.437、4.268、13.625，P<0.05)，見表4。

2.4 老年2型糖尿病合并下肢血管病變影響因素ROC曲線分析 AUC比較，TC>miR-27 mRNA>25(OH)D3，miR-27 mRNA、25(OH)D3診斷老年2型糖尿病下肢血管病變的敏感度、特異度相近(P>0.05)，均小于TC(P<0.05)；TC、miR-27 mRNA、25(OH)D3的cut-off值為5.432、2.936、24.413 mmol/L；約登指數(shù)為0.498、0.364、0.369，見表5、圖1。

3 討 論

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。下肢血管疾病是常見的糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，且發(fā)病率逐年上升。糖尿病合并下肢血管疾病的主要病理變化是動(dòng)脈粥樣硬化。據(jù)報(bào)道，增加的活性氧產(chǎn)物和減少的抗氧化劑在動(dòng)脈粥樣硬化形成中起重要作用。例如，血清超氧化物歧化酶(SOD)和高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平是2型糖尿病伴下肢血管疾病發(fā)病的關(guān)鍵。作為抗氧化劑，SOD主要存在于細(xì)胞代謝中，通過有毒自由基歧化為無活性的過氧化氫和氧分子在細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用[8]。血糖升高可以提高糖基化蛋白的水平。血糖和糖基化蛋白的自身氧化會(huì)增加糖尿病患者的自由基水平，抑制抗氧化能力。糖尿病誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。SOD在全身血管疾病中起重要作用。研究表明，miR-27高表達(dá)能促進(jìn)hs-CRP表達(dá)，抑制SOD水平。本研究中，T2DM組miR-27 mRNA水平高于對照組；LLPAD亞組miR-27 mRNA水平高于Non-LLPAD亞組，證實(shí)了上述結(jié)論。

許多證據(jù)表明，25(OH)D3在高血糖、胰島素抵抗(IR)和T2DM的發(fā)展中也有作用，并且有越來越多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其可以降低全身性炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)和脂肪酶的代謝，從而降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。第三次全國健康和營養(yǎng)檢查調(diào)查(NHANES-Ⅲ)發(fā)現(xiàn)，與正常濃度25(OH)D3的居民相比，低濃度25(OH)D3的居民外周動(dòng)脈疾病的發(fā)生率更高。本研究中，與對照組比較，T2DM組25(OH)D3平降低；與Non-LLPAD亞組比較，LLPAD亞組25(OH)D3水平降低，這與上述討論一致。25(OH)D3是保護(hù)糖尿病患者免于下肢血管疾病發(fā)病的一個(gè)因素。25(OH)D3可能通過以下機(jī)制參與糖尿病下肢血管病變:維生素D可以通過調(diào)節(jié)胰腺組織中的維生素D受體(VDR)和維生素D依賴性鈣結(jié)合蛋白(DBP)來促進(jìn)胰腺細(xì)胞分泌胰島素。它也可通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子和抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的表達(dá)來降低周圍組織的IR。此外，它還可以通過刺激PPARδ和胰島素受體的基因表達(dá)來影響胰島素敏感性。骨化三醇可以調(diào)節(jié)腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，抑制腎素的表達(dá)，調(diào)節(jié)合成和分泌。維生素D可以上調(diào)延遲血管鈣化相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括血管內(nèi)皮生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶9。

表4 老年2型糖尿病合并下肢血管病變發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

表5 老年2型糖尿病合并下肢血管病變影響因素ROC曲線分析

miRNA是長度約為23 nt的內(nèi)源性小非編碼RNA。血管疾病患者在疾病早期具有某些循環(huán)miRNA水平恒定模式。最近的一項(xiàng)研究表明，血管生物學(xué)中的不同miRNA可直接或間接地參與血管重塑中基礎(chǔ)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，因此，特定的miRNA可以作為潛在的生物標(biāo)志物。研究表明，基于miRNA的方法可以抑制增殖性血管平滑肌細(xì)胞，可以預(yù)防再狹窄，同時(shí)選擇性地促進(jìn)再內(nèi)皮化和保留內(nèi)皮細(xì)胞功能[9-10]。抑制miR-27表達(dá)有助于抑制再狹窄和血栓形成，從而保留內(nèi)皮功能。miR-27位于17號染色體上，是miRNA家族的一個(gè)亞型，具有自己的啟動(dòng)子區(qū)。miR-27的過度表達(dá)被證明涉及多種病理狀態(tài)，包括癌癥和心血管疾病，并且它可以通過調(diào)節(jié)特定細(xì)胞來影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[11-12]。miR-27的反義敲低，可以防止頸內(nèi)動(dòng)脈球囊損傷后新內(nèi)膜損傷的形成。miR-27可以通過促進(jìn)血管生成來加劇動(dòng)脈鈣化和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，平滑肌細(xì)胞增殖，并通過免疫細(xì)胞的VDR介導(dǎo)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。miR-27過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血清甲狀旁腺激素(PTH)水平升高。過高的PTH水平可能至少通過增加心臟收縮力和心肌鈣化而部分促進(jìn)心血管疾病。 miR-27可通過促進(jìn)炎性細(xì)胞因子(如IL-6、TNF-α和CRP)的分泌來加劇動(dòng)脈壁的慢性炎性反應(yīng)。

研究表明[13-15]，在外周血管疾病的發(fā)病過程中IL-1、PDGF、TNF-α等炎性因子的分泌及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉淀均與25(OH)D3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)低度表達(dá)的25(OH)D3可通過增加細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，進(jìn)而使血管內(nèi)壁增粗狹窄[16-17]。本結(jié)果顯示，miR-27 mRNA與25(OH)D3呈負(fù)相關(guān)，這與上述結(jié)論符合。

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高水平miR-27 mRNA為老年2型糖尿病合并下肢血管病變發(fā)生的危險(xiǎn)因素；miR-27 mRNA、25(OH)D3兩者的AUC相近，均小于TC；miR-27 mRNA、25(OH)D3診斷老年2型糖尿病下肢血管病變的敏感度、特異度相近，均小于TC，說明miR-27、25(OH)D3診斷老年2型糖尿病下肢血管病變具有較高的敏感度、特異度，可作為判定老年2型糖尿病下肢血管病變的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，老年2型糖尿病下肢血管病變患者血清miR-27水平升高，其與25(OH)D3呈顯著負(fù)相關(guān)；miR-27診斷2型糖尿病下肢血管病變具有較高的敏感度、特異度，可作為判定2型糖尿病下肢血管病變的生物學(xué)標(biāo)志物，值得臨床推廣。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

陳云霞：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；蘇俊平：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；劉海勇：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；陳雪：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；馬瑩：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫