劉春燕,劉小燕,李平,陳國才,耿召華

冠心病是臨床上最常見的心血管疾病之一，近年來隨著高脂血癥、高血壓、糖尿病、肥胖癥等代謝性疾病的增多，冠心病的發(fā)生率也呈逐年升高的趨勢，并對患者的生活質(zhì)量、生命安全均造成威脅[1]。在冠心病的病情發(fā)展變化過程中，冠狀動脈斑塊的形成及性質(zhì)的改變與脂代謝紊亂、炎性反應(yīng)異常激活等環(huán)節(jié)密切相關(guān)，但具體的調(diào)控機(jī)制仍未十分明確。人枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是由肝細(xì)胞表達(dá)并分泌的一類前蛋白轉(zhuǎn)化酶，能夠降解低密度脂蛋白膽固醇受體(LDLR)，影響LDLR所介導(dǎo)的LDL-C代謝并使LDL-C在體內(nèi)蓄積，蓄積的LDL-C在冠狀動脈內(nèi)膜沉積、逐步形成粥樣斑塊[2-3]。PCSK9基因在多位點(diǎn)存在多態(tài)性，多態(tài)性的產(chǎn)生會使編碼產(chǎn)物降解LDLR的活性發(fā)生改變，進(jìn)而影響LDL-C的代謝并參與動脈粥樣硬化的進(jìn)程。 筆者分析了冠心病患者PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性與斑塊性質(zhì)、脂代謝及細(xì)胞因子的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月—2018年6月陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院心內(nèi)科診斷冠心病患者120例作為冠心病組，男69例，女51例，年齡42～62(51.39±7.65)歲；合并高血壓46例，糖尿病37例，高脂血癥61例；有冠心病家族史23例。另納入同期于醫(yī)院體檢的健康者100例作為健康對照組，男58例，女41例，年齡39～60(49.93±7.12)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)入組標(biāo)準(zhǔn)：①均有發(fā)作性胸痛癥狀、經(jīng)冠狀動脈CTA確診為冠心病；②首次診斷為冠心病。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并先天性心臟病、冠狀動脈血管畸形；②既往有腦梗死、心肌梗死病史的患者；③合并自身免疫性疾病的患者；④正在服用他汀類藥物的患者。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 基因多態(tài)性檢測： 2組受試者均于晨起空腹時(shí)采集肘靜脈血2 ml并以EDTA抗凝，按照北京天根公司的血液基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行操作，設(shè)計(jì)PCSK9基因V312F位點(diǎn)的引物(上游5’-AAAGGGGAGCAGGTCTCCC-3’、下游5’-GCCCGCCCTCCCTCCGCCCTCCG-3’)，配置PCR反應(yīng)體系50 μl后,按照95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s的程序反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，收集PCR產(chǎn)物后用ABI(型號：3100Avant)全自動DNA測序儀測定基因序列，根據(jù)測序結(jié)果判斷V312F位點(diǎn)的多態(tài)性。

1.3.2 冠狀動脈斑塊測定： 采用64排雙源CT儀進(jìn)行冠脈CTA檢查，掃描范圍為主動脈弓肺動脈節(jié)段起始至膈肌下1 cm為止；將感興趣區(qū)設(shè)置在升主動脈，當(dāng)CT值達(dá)到100 HU時(shí)觸發(fā)掃描，掃描參數(shù)為電壓120 kV、電流280 mA、層厚0.75 mm、機(jī)架旋轉(zhuǎn)時(shí)間0.28 s、球管旋轉(zhuǎn)時(shí)間0.33 s/r。將圖像信息錄入影像工作站后測定粥樣斑塊的CT值(CT值<60 HU為軟斑塊，60～129 HU為纖維斑塊，≥130 HU為鈣化斑塊)。

1.3.3 血脂檢測：2組患者均取空腹靜脈血，離心取血清，采用全自動生化分析儀檢測低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、小而密低密度脂蛋白膽固醇(sdLDL-C)的含量。

1.3.4 細(xì)胞因子檢測： 2組患者均取空腹靜脈血，離心取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定趨化素(chemerin)、脂肪特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑(vaspin)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1α(SDF-1α)的含量。

2 結(jié) 果

2.1 2組PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性比較 冠心病組患者PCSK9基因V312F位點(diǎn)TT+TG基因型的比例明顯高于健康對照組，GG基因型的比例明顯低于健康對照組(P<0.01)；T等位基因的比例明顯高于健康對照組，G等位基因的比例明顯低于健康對照組(P<0.01)，見表1。

2.2 不同斑塊性質(zhì)患者PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性比較 不同斑塊性質(zhì)患者PCSK9基因V312F位點(diǎn)TT+TG基因型、GG基因型及PCSK9基因V312F位點(diǎn)T等位基因、G等位基因比例比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 不同PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性患者血脂比較 冠心病組中TT+TG基因型患者的血清LDL-C、sdLDL-C、chemerin含量明顯高于GG基因型患者，HDL-C、vaspin含量明顯低于GG基因型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

2.4 不同PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性患者細(xì)胞因子比較 冠心病組中TT+TG基因型患者血清M-CSF、IL-6、TNF-α、SDF-1α含量均高于GG基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

3 討 論

LDL-C是冠狀動脈粥樣斑塊的重要成分，體內(nèi)脂代謝紊亂及炎性反應(yīng)過度激活均會促進(jìn)LDL-C在動脈內(nèi)膜沉積并形成粥樣斑塊。PCSK9是體內(nèi)調(diào)節(jié)LDL-C代謝過程的蛋白酶，該蛋白酶通過水解LDLR來阻礙LDL-C代謝，造成LDL-C蓄積，冠心病患者的血清PCSK9含量明顯升高，但引起PCSK9含量升高的機(jī)制尚未完全明確?；蚨鄳B(tài)性是近年來受到越來越多關(guān)注的分子表達(dá)調(diào)控機(jī)制，PCSK9基因被證實(shí)在V312F、D320N、E670G等多個(gè)位點(diǎn)存在多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)等位基因的突變會造成基因表達(dá)發(fā)生改變及PCSK9分泌的變化[4-6]。V312F位點(diǎn)的突變類型為等位基因G向T的突變，突變后形成雜合基因型TG及純合基因型TT。為了明確PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病發(fā)病的關(guān)系，本研究首先分析了冠心病患者PCSK9基因V312F位點(diǎn)的基因型及等位基因，結(jié)果顯示，冠心病組患者PCSK9基因V312F位點(diǎn)TT+TG基因型的比例、T等位基因的比例明顯高于健康對照組，GG基因型的比例、G等位基因的比例明顯低于健康對照組，提示冠心病患者存在PCSK9基因V312F位點(diǎn)G向T的突變，該多態(tài)性與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)。

在動脈粥樣斑塊形成的過程中，LDL-C在動脈內(nèi)膜沉積，隨著炎性反應(yīng)的激活，巨噬細(xì)胞在動脈內(nèi)膜大量浸潤、吞噬LDL-C并形成泡沫細(xì)胞。LDL-C及泡沫細(xì)胞不斷聚集、逐步成為粥樣斑塊[7-8]。冠心病患者體內(nèi)冠狀動脈粥樣斑塊的性質(zhì)呈動態(tài)變化，在斑塊形成的初期階段、斑塊性質(zhì)穩(wěn)定，患者的病情也相對穩(wěn)定；隨著斑塊體積增大、斑塊內(nèi)LDL-C增多及斑塊纖維帽在蛋白酶的作用下發(fā)生水解，斑塊的穩(wěn)定性逐步下降，若發(fā)生斑塊破裂則會誘發(fā)血栓形成、出現(xiàn)心肌梗死。PCSK9直接影響LDL-C的代謝，在明確PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病發(fā)病的關(guān)系后，本研究進(jìn)一步分析了PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病患者斑塊性質(zhì)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同斑塊性質(zhì)患者PCSK9基因V312F位點(diǎn)TT+TG基因型、GG基因型的比例及T等位基因、G等位基因的比例有顯著差異，斑塊性質(zhì)越不穩(wěn)定，TT+TG基因型的比例及T等位基因的比例越高。這一結(jié)果提示冠心病患者體內(nèi)PCSK9基因V312F位點(diǎn)G向T的突變會影響斑塊性質(zhì)、使斑塊的穩(wěn)定性下降。

表1 2組PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性的比較

表2 冠心病組中不同斑塊性質(zhì)患者PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性的比較

表3 冠心病組中不同PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性患者血脂指標(biāo)的比較

表4 冠心病組中不同PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性患者血清細(xì)胞因子的比較

PCSK9在體內(nèi)主要參與LDL-C的代謝，LDL-C代謝紊亂會進(jìn)一步影響其他脂質(zhì)成分的代謝。LDL-C升高被認(rèn)為是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而HDL-C則被認(rèn)為是心腦血管疾病的保護(hù)因素，其功能是促進(jìn)膽固醇由外周組織向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)并通過肝臟代謝膽固醇[9-10]。脂代謝紊亂除了表現(xiàn)為LDL-C和HDL-C的變化外，多種脂肪因子的分泌也發(fā)生變化。vaspin和chemerin是2種功能不同的脂肪細(xì)胞因子，前者能夠增加胰島素敏感性，具有心血管保護(hù)作用，后者能夠拮抗胰島素的生物學(xué)活性、具有促炎作用[11-12]。冠心病患者血清中LDL-C及chemerin的含量明顯升高，而HDL-C及vaspin的含量明顯下降。本研究進(jìn)一步分析了不同PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性冠心病患者脂代謝指標(biāo)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TT+TG基因型患者的血清LDL-C、sdLDL-C、chemerin含量明顯高于GG基因型患者，HDL-C、vaspin含量明顯低于GG基因型患者。這一結(jié)果提示冠心病患者體內(nèi)PCSK9基因V312F位點(diǎn)G向T的突變會影響脂代謝過程。

動脈粥樣斑塊的形成涉及脂代謝紊亂及炎性反應(yīng)的過度激活，炎性反應(yīng)激活過程中巨噬細(xì)胞在動脈內(nèi)膜大量浸潤，吞噬LDL-C后成為泡沫細(xì)胞并形成粥樣斑塊。炎性細(xì)胞因子的瀑布式分泌是炎性反應(yīng)激活的重要特征，M-CSF、IL-6、TNF-α、SDF-1α是已知的炎性細(xì)胞因子，在冠心病患者血清中的含量明顯升高[13]。M-CSF和TNF-α具有促炎作用，能夠使多種炎性細(xì)胞發(fā)生活化[14]；IL-6、SDF-1具有趨化活性，能夠促進(jìn)多種炎性細(xì)胞的遷移并向粥樣斑塊浸潤[15-16]。本研究通過分析不同PCSK9基因V312F位點(diǎn)多態(tài)性冠心病患者細(xì)胞因子的變化發(fā)現(xiàn)，TT+TG基因型患者的血清M-CSF、IL-6、TNF-α、SDF-1α含量明顯高于GG基因型患者。這一結(jié)果提示冠心病患者體內(nèi)PCSK9基因V312F位點(diǎn)G向T的突變會促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)患者體內(nèi)的炎性反應(yīng)。

綜上所述，冠心病患者PCSK9基因V312F位點(diǎn)存在明顯多態(tài)性，具體表現(xiàn)為等位基因G向T的突變；該多態(tài)性能夠降低斑塊穩(wěn)定性，影響冠心病患者體內(nèi)的脂代謝及細(xì)胞因子分泌。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉春燕：負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、開展和論文撰寫；劉小燕、李平：負(fù)責(zé)臨床信息收集；陳國才：負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；耿召華：論文撰寫、修改