薛超 馬文娜 孫慶文 李沖杰

近年來,隨著干細(xì)胞研究的興起，國內(nèi)外陸續(xù)有關(guān)于干細(xì)胞臨床應(yīng)用的報(bào)道[1-3]，但多局限于短期的療效觀察，缺乏嚴(yán)格的對照。本研究對乙肝肝硬化患者采用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)靜脈輸注移植聯(lián)合傳統(tǒng)的抗病毒等綜合治療方法，對其治療后半年臨床療效進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

選擇2017年10月至2018年3月山東醫(yī)專附屬醫(yī)院收治的失代償期肝硬化患者12例，其中男性8例，女性4例，年齡48～78歲，平均年齡57.4歲。12例患者均為乙型肝炎肝硬化，Child-Pugh分級：B級5例，C級7例。所有患者均行腹部B超和(或)CT 檢查，實(shí)驗(yàn)室檢查包括ALT、AST、總膽紅素(TBil)、白蛋白(Alb)、膽堿酯酶(CHE)[4-6]。所有患者進(jìn)行干細(xì)胞移植治療前均給予傳統(tǒng)控制水鈉攝入、保肝、糾正低蛋白血癥等內(nèi)科綜合治療，所有患者在知情同意情況下簽署《知情同意書》。另選擇15例同時間段該院收治的失代償期肝硬化患者，年齡46-73歲，平均年齡56.8歲，只給予傳統(tǒng)內(nèi)科綜合治療，作為對照組。

二、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采集、分離和鑒定

(一)臍帶干細(xì)胞采集 選擇臨沂市婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)科剖腹產(chǎn)健康產(chǎn)婦, 排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒以及其他傳染性疾病，無病理妊娠，胎兒娩出斷臍后，清洗消毒，裁剪約15～30 cm臍帶，置于裝有保存液的采樣瓶中，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

(二)臍帶干細(xì)胞分離 用貼壁法分離提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，提取試劑盒購自Gibco和Helios公司，耗材用品購自上海百賽生物技術(shù)有限公司。操作嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行分離提取，37°C、5% CO2濃度培養(yǎng)后，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，每例臍帶提取間充質(zhì)干細(xì)胞總數(shù)不低于1×109。

(三)臍帶干細(xì)胞鑒定 免疫熒光標(biāo)記抗體CD29-APC、CD90-PE、CD105-FITC、CD34-PE和CD45-PerCP購自BD公司，細(xì)胞被抗體標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，收獲目的活性細(xì)胞不小于95%間充質(zhì)干細(xì)胞。

三、移植方法

經(jīng)計(jì)數(shù)和檢測合格的細(xì)胞，洗滌3次，徹底去除培養(yǎng)基殘留，按照5×107個/制劑的標(biāo)準(zhǔn)用生理鹽水稀釋制備成150 mL細(xì)胞懸液。經(jīng)靜脈滴注，將含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的150 mL生理鹽水懸液注入到患者體內(nèi)，滴速為45～65滴/min，連續(xù)靜脈滴注3次，每次間隔1周。

四、療效觀察

觀察指標(biāo)主要包括以下幾個方面：臨床癥狀、體征和不良反應(yīng)；干細(xì)胞移植術(shù)后1周、4周、12周、24周肝功(ALT、AST、TBil、Alb、CHE)和B超等。

五、數(shù)據(jù)分析

結(jié) 果

一、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

經(jīng)分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞大小均勻，呈長形或梭形。經(jīng)全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測，間充質(zhì)干細(xì)胞活率約為93%，高于業(yè)內(nèi)85%的要求。培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，檢測結(jié)果CD29+、CD90+、CD105+、CD34-和CD45-等表面標(biāo)志物提示目的細(xì)胞的比率分別為99.9%、99.9%、99.8%、99.9%和98.0%，符合目的細(xì)胞不低于95%的要求(圖1)。

圖1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物流式檢測

二、臨床癥狀與體征變化

在接受干細(xì)胞治療的試驗(yàn)組患者與對照組患者中，腹水、腹脹、下肢浮腫、納差、乏力等臨床癥狀均有不同程度的改善，在治療后24周左右，試驗(yàn)組患者改善程度高于對照組患者。此外，試驗(yàn)組患者中，有5例患者闡述其睡眠質(zhì)量明顯改善，4例患者出現(xiàn)面容好轉(zhuǎn)。

三、肝功能變化

在干細(xì)胞治療試驗(yàn)組患者和對照組患者中，肝功能指標(biāo)均有不同程度的改善，在治療后12周時，除膽堿酯酶無明顯變化外，試驗(yàn)組肝功能指標(biāo)評估改善顯著高于對照組(P<0.05)，其中白蛋白變化尤為明顯，預(yù)示試驗(yàn)組肝臟儲備功能改善良好，干細(xì)胞對患者肝臟功能起到良好的修復(fù)作用。在治療24周時，數(shù)據(jù)變化不再明顯，兩組患者對比差異無顯著意義(P>0.05)(見表1)。

表1 患者肝功能指標(biāo)變化

四、不良事件與安全性

在所有接收臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的患者中，移植成功率100%，術(shù)后出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)3例，均不超過38 ℃，未給予處理，8 h后自動消退；出現(xiàn)精神亢奮1例，次日恢復(fù)正常；未發(fā)生感染和白細(xì)胞下降等情形。術(shù)后跟蹤隨訪過程中，對照組因死亡失訪1例。

討 論

已有研究證實(shí)，干細(xì)胞在肝硬化環(huán)境中能夠增殖分化[8]，且已有諸多將自體骨髓干細(xì)胞應(yīng)用于治療肝硬化患者的報(bào)道[7-8]。但考慮到肝硬化患者常伴有骨髓造血功能減退及骨髓增生不良，干細(xì)胞增殖分化能力下降，骨髓穿刺采集的骨髓干細(xì)胞數(shù)量很難達(dá)到干細(xì)胞移植治療需要的細(xì)胞數(shù)量，而且患者病情嚴(yán)重，患者不能耐受采集大量骨髓液，也不安全[4]。與之相比，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便，來源廣，數(shù)量充足，增殖分化能力強(qiáng)，免疫原性低，干性維持良好[9]的優(yōu)勢，越來越受到醫(yī)生和患者的重視。

本研究對12例失代償期肝硬化患者，使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行靜脈輸注移植治療，治療后隨訪結(jié)果顯示，接收干細(xì)胞治療的多數(shù)患者臨床癥狀腹水消退，腹脹、下肢浮腫減輕、食欲和體力改善明顯；肝功能較治療前也有明顯好轉(zhuǎn)，且較對照組改善具有顯著差異性。研究結(jié)果表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療能良好修復(fù)肝損傷，改善肝功能，并且安全可行，無不良風(fēng)險。

目前，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝硬化作為一種新的治療方法尚處于臨床探索階段，報(bào)道的研究普遍存在病例數(shù)量較少，跟蹤隨訪時間較短，缺乏對照和遠(yuǎn)期療效評級不足等問題。本試驗(yàn)雖然設(shè)置了對照組，但也存在數(shù)量較少，跟蹤時間較短等缺陷。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝硬化長期療效評價還需要大量樣本和嚴(yán)格的對照研究，建立標(biāo)準(zhǔn)化移植方式、細(xì)胞數(shù)量等問題還需進(jìn)一步研究和探討，促進(jìn)干細(xì)胞移植后的完全轉(zhuǎn)化以更有效的重建和改善肝組織和肝功能也是今后研究的重點(diǎn)工作內(nèi)容。