王文廣 匡德宣 仝品芬 李 娜 陸彩霞 罕園園 孫曉梅 代解杰

(中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心、云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室、云南省眼科疾病防治研究重點實驗室、中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應用研究省創(chuàng)新團隊, 昆明 650118)

樹鼩(TupaiaBelangeris， Tree Shrew)是一種形似松鼠、吻部較長的小型哺乳動物，目前在分類學上屬于攀鼩目，介于靈長目與食蟲目之間。樹鼩主要分布于南亞、東南亞及我國南部如云南、貴州、廣西、廣東、海南等省區(qū)，其中應用最為廣泛的是中緬樹鼩滇西亞種。樹鼩與靈長類動物的進化關系比嚙齒類動物更接近，在生命科學研究領域有很大的應用潛力，世界衛(wèi)生組織在20世紀90年代就建議用樹鼩代替大型靈長類動物進行科學實驗。

早期研究中使用的樹鼩大多來自野外，它們的遺傳背景不清，健康狀況未知，且個體差異較大，不利于科學研究的順利進行，因此需要大力開展樹鼩的標準化建設。我國從20世紀70-80年代就開始了樹鼩人工馴養(yǎng)繁殖研究，研究力量主要集中在昆明，如中國科學院昆明動物研究所、中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所和昆明醫(yī)科大學等科研院校。在國家和地方科技項目的不斷大力支持下，科研人員對樹鼩的標準化建設工作進行了系統(tǒng)性研究，并取得了突破性成果。

1 樹鼩的主要生物學特性

1.1 樹鼩的體型特征

樹鼩形似松鼠，但吻部較長，耳朵較短，尾毛發(fā)達向兩側(cè)分散。成年樹鼩一般體長14～19 cm，體質(zhì)量120～180 g。前后足均有五趾，每趾都有尖爪。犬齒細小，前臼齒寬大。頭骨的眶后突發(fā)達，形成一骨質(zhì)眼球，腦室較大。體毛粟黃色，頜下及腹部為淺灰色。

1.2 樹鼩的野外習性

野生樹鼩多在丘陵、平原近農(nóng)舍旁的灌木丘林里活動，在土丘中挖洞作穴，亦有在樹上筑巢，雌雄成對生活，不群居。常見單個出沒于叢林或村落，行動靈活，善于攀緣。樹鼩是雜食性動物，常以昆蟲、小鳥、五谷野果為食，更喜甜食如蜂蜜。

1.3 樹鼩的籠養(yǎng)特性

樹鼩常在籠內(nèi)作翻滾竄跳活動，以黎明和黃昏時最為活躍。樹鼩好動能耗大，飼料中應有足夠的蛋白質(zhì)，并搭配合適的水果，以保證營養(yǎng)。兩雄好斗，不宜同籠，宜將雌雄樹鼩1∶1配對。樹鼩生性膽小，易受驚，如長時間處于應激狀態(tài)時，會導致采食量下降、生長受阻、繁育率下降等。因此，籠養(yǎng)時應注意控制噪聲，溫度維持在20～28 ℃為宜，濕度應控制在40%～70%之間。

1.4 樹鼩的繁育特性

樹鼩性成熟時間約為6個月，懷孕期42 d左右，每胎產(chǎn)仔2～4只，每年3-8月為生殖季節(jié)。母樹鼩懷孕后應盡早分籠單養(yǎng)，保證溫和的孕育環(huán)境，受刺激后易流產(chǎn)或產(chǎn)后食仔和拒養(yǎng)。子樹鼩初生時體質(zhì)量約10 g，頭身長(6.4±0.4) cm，尾長(3.8±0.29) cm，全身無毛，皮膚粉紅，眼閉，只會蠕動，5～6 d皮膚變黑，開始長毛，14～21 d開眼，3周開始走動，4周可跳動，5～6周斷奶而獨立生活。

2 樹鼩的標準化研究

樹鼩的標準化工作一直是在國家實驗動物資源發(fā)展規(guī)劃的戰(zhàn)略指導下有序推進的，持續(xù)受到科技部科技支撐計劃項目和云南省科技基礎條件平臺計劃項目的大力支持，尤其是在國家科技支撐計劃項目“實驗用樹鼩的標準化研究和人類重大疾病樹鼩模型創(chuàng)建與應用集成示范”順利實施后，樹鼩種質(zhì)資源基地建設已經(jīng)完成，樹鼩質(zhì)量技術體系日趨完善，樹鼩團體標準也得以頒布實施，其標準化研究水平得到空前提高。

樹鼩標準的制定是推動樹鼩實驗動物化的有力保證，早在2010年11月云南省就發(fā)布了地方標準《實驗樹鼩(DB53/T328.1-328.5-2010)》，并于2011 年3月1日正式實施，主要由昆明醫(yī)科大學制定，其內(nèi)容共分為5個部分：1. 實驗樹鼩(第1部分)：微生物學等級及檢測(DB53/T 328.1); 2. 實驗樹鼩(第2部分)：寄生蟲學等級及檢測(DB53/T 328.2); 3. 實驗樹鼩(第3部分)：遺傳學質(zhì)量控制(DB53/T 328.3); 4.實驗樹鼩(第4部分)：配合飼料(DB53/T 328.4); 5.實驗樹鼩(第5部分)：環(huán)境及設施(DB53/T 328.5)。2012年5月又發(fā)布了由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所和昆明理工大學制定的實驗樹鼩云南省地方標準第6～10部分，即飼養(yǎng)管理、生物學特性數(shù)據(jù)測定、實驗基本操作技術、HCV病毒感染樹鼩原代肝細胞模型制作和 HCV病毒感染樹鼩模型制作。云南省樹鼩地方標準的頒布填補了當時我國實驗樹鼩無質(zhì)量標準的空白，為樹鼩人工繁殖和實驗研究提供了有力的技術支持。

近年來，隨著大量實驗數(shù)據(jù)的積累，人們也不斷地對樹鼩的地方標準進行修訂和完善，并努力向著應用范圍更廣的樹鼩國家標準靠近，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所制定的6項樹鼩團體標準于2017年5月獲得全國實驗動物標準化委員會頒布，分別是(1)T/CALAS 08-2017 實驗動物 樹鼩微生物學等級及監(jiān)測；(2)T/CALAS 09-2017 實驗動物 樹鼩寄生蟲學等級及監(jiān)測；(3)T/CALAS 10-2017 實驗動物 樹鼩環(huán)境與設施；(4)T/CALAS 11-2017 實驗動物 樹鼩遺傳質(zhì)量控制；(5)T/CALAS 12-2017 實驗動物 樹鼩配合飼料；(6)T/CALAS 13-2017 實驗動物 樹鼩病理學診斷規(guī)范。該團體標準的頒布實施，為樹鼩作為實驗動物的標準化提供更科學的技術支持，并有力推動了樹鼩在全國范圍的推廣和應用。

3 實驗用樹鼩的應用研究

3.1 感染性疾病模型的研究

先后有人甲肝、乙肝、丙肝和丁肝病毒感染樹鼩，均在樹鼩體內(nèi)發(fā)現(xiàn)病毒復制，并觀察到一定的臨床癥狀，其中以乙肝病毒和丙肝病毒模型研究成果較為突出。 Glebe等發(fā)現(xiàn)HBV 可有效感染成年樹鼩原代肝細胞，證明pre-S1結構域是樹鼩肝細胞感染HBV必需的抗原，這一點與HBV感染人肝細胞的方式相似[1]。Yan等以人類HBV感染樹鼩原代肝細胞模型為基礎，成功證明了靈長類動物的鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白為HBV 感染肝細胞的特異性受體[2]。謝春志等[3]、馮悅[4]通過含HCV的人血清感染樹鼩，均發(fā)現(xiàn)樹鼩可感染人HCV。Barth等[5]研究發(fā)現(xiàn)樹鼩肝細胞上I型清道夫受體、CD81分子在HCV包膜粘合到樹鼩肝細胞中起了重要作用。隨后，Tong等[6]報道了樹鼩CD81分子、SR-BI分子和Claudin-1分子可介導HCV感染。就目前的研究資料看，除人和黑猩猩外，樹鼩是經(jīng)證實能感染人乙、丙型肝炎病毒的小型哺乳類動物，可以彌補其他動物如嚙齒類動物和禽類動物病毒性肝炎模型的不足。

流感病毒亦可感染樹鼩，研究發(fā)現(xiàn)H1N1流感病毒可能在樹鼩的上呼吸道復制，使其表現(xiàn)出輕微或中度的呼吸道癥狀及呼吸道的病理變化，發(fā)現(xiàn)廣泛分布于氣管和鼻黏膜的受體是sialic acid (SA)a2，6-gal，而肺組織中的主要受體是(SA)a2，3-gal[7]。

樹鼩還有望成為手足口病動物模型，王文廣等[8]對3個月齡的樹鼩進行EV71感染實驗，發(fā)現(xiàn)其體溫、白細胞和淋巴細胞水平均有升高趨勢；感染后2周，部分樹鼩表現(xiàn)出急性松弛性癱瘓癥狀，并伴有尿潴留，組織病理學檢查在腦、心、肺、脾、腎等部位發(fā)現(xiàn)相應的病理變化，表明EV71 病毒可感染幼齡樹鼩。Li等[9]用CA16 感染樹鼩后，在其多種器官以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和糞便中發(fā)現(xiàn)高載量病毒，同時肺、腎等組織中也出現(xiàn)細胞損傷和炎性細胞侵潤等病理反應，說明樹鼩對CA16 具有敏感性，適合發(fā)展為研究CA16的潛在動物模型。

另外，人們還發(fā)現(xiàn)登革病毒[10]、HSV病毒[11]、EB病毒[12]可感染樹鼩，可用來建立感染模型開展研究。

3.2 神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型

何保麗等[13]用β-淀粉樣蛋白(Aβ)側(cè)腦室注射建立樹鼩老年癡呆模型，從模型制作后第8天開始，治療組樹鼩連續(xù)30 d灌胃給予天麻素，通過RT-PCR檢測海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)mRNA的表達，結果顯示天麻素能在一定程度上上調(diào)樹鼩海馬BDNF的表達。

Ma等[14]對樹鼩連續(xù)腹腔注射MPTP[3 mg/(kg·d-1)]，5 d后出現(xiàn)典型的帕金森運動癥狀，且紋狀體DA和DOPA水平顯著降低，腦中α-synuclein mRNA水平升高，提示樹鼩可能是研究PD 發(fā)病機制的潛在動物模型。鄧苙等[15]的研究指出樹鼩MPTP模型與6-OHDA模型相比，PD 行為學特征更明顯，樹鼩的TH陽性神經(jīng)細胞呈雙側(cè)性減少，提示MPTP 經(jīng)腹腔注射是制備樹鼩PD 模型的理想方法。

有學者注射不同劑量嗎啡到樹鼩體內(nèi)以研究其耐受性和依賴性，注射嗎啡后同時使用納洛酮(1.25 mg/kg體質(zhì)量)，發(fā)現(xiàn)樹鼩出現(xiàn)誘導條件性位置厭惡和戒斷癥狀[16]。Shen等[17]使用樹鼩開展嗎啡成癮性研究，結果顯示肌肉注射嗎啡(5或10 mg/kg)30～60 min后樹鼩的運動活性顯著增加；條件性位置偏愛/厭惡實驗結果顯示，樹鼩偏愛有嗎啡的盒子，而納洛酮誘導條件性位置厭惡；以上研究表明樹鼩可以成為成癮行為和神經(jīng)機制研究的候選者。

Meng等[18]利用樹鼩先后建立了社交挫敗模型、習得性無助模型及慢性溫和應激模型，通過藥物抗抑郁實驗發(fā)現(xiàn)，氯丙咪嗪能夠逆轉(zhuǎn)抑郁動物的社交退縮行為，氟西汀對習得性無助行為具有翻轉(zhuǎn)作用，而卡貝縮宮素則對興趣下降、社交退縮及習得性無助行為均具有顯著的治療效果[19]。

3.3 眼科疾病模型研究

樹鼩眼球解剖及視覺系統(tǒng)與人類有高度相似性，感光細胞以視錐細胞為主，對形覺剝奪環(huán)境極為敏感，是研究形覺剝奪性近視的極佳動物模型。Siegwart和Norton[20]將自然睜眼后7 d、15 d、21 d、33 d、48 d、63 d樹鼩分別用半透明遮光板單眼剝奪12 d觀察眼軸的延長，發(fā)現(xiàn)樹鼩近視的易感期的高峰時段大約發(fā)生在睜眼后15～45 d之間。周廣龍等[21]通過單眼形覺剝奪建立樹鼩弱視模型，發(fā)現(xiàn)形覺剝奪引起的神經(jīng)元損傷具有可恢復性，C-fos基因和蛋白可能參與了形覺剝奪視皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷及可塑性，結果顯示樹鼩有潛力成為良好的形覺剝奪弱視模型。

李妍等[22]采用基質(zhì)注射茄病鐮刀菌孢子的方法首次成功建立茄病鐮刀菌性角膜炎樹鼩模型，并發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-1β和IL-6及抑炎因子IL-10在樹鼬茄病鐮刀菌性角膜炎炎癥反應機制中發(fā)揮重要作用。Samuels 等[23]向成年樹鼩眼睛前房中注射25 mg/mL的磁珠溶液，從而誘發(fā)青光眼，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(RNFL)顯著減少，視神經(jīng)表現(xiàn)出與青光眼性視神經(jīng)病變相一致的組織病理學變化。

3.4 代謝疾病模型研究

Li等[24]采用高糖脂肪飲食與地塞米松聯(lián)合誘發(fā)了樹鼩2型糖尿病。Wu等[25]使用不同劑量的STZ (60、70和80 mg/kg)也建立了類似的2型糖尿病樹鼩模型。此外，有人通過高糖高脂肪飲食和4次STZ 注射成功建立了糖尿病腎病樹鼩模型，并通過實驗證明骨髓移植也可以提高胰島素抵抗性[26]。

Xing等配置不同濃度的食用酒精溶液供樹鼩飲用，2周后引發(fā)酒精代謝酶改變和脂肪肝樣病理改變[27]，而Meng等人發(fā)現(xiàn)羅格列酮可以預防樹鼩的脂肪肝發(fā)育[28]。Zhang等[29]使用高脂肪、膽固醇和膽酸鹽飲食，成功地在樹鼩中誘發(fā)了非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，發(fā)現(xiàn)Poloxamer 407對脂蛋白脂肪酶的抑制改善了脂肪病的嚴重程度，減輕了炎癥，與小鼠脂肪肝病模型相比，樹鼩模型發(fā)病時間較短且癥狀更為明顯。

3.5 樹鼩細胞的開發(fā)和應用

樹鼩細胞也是樹鼩資源的有機組成部分，同時也是重要的體外實驗平臺，目前文獻報道已經(jīng)成功分離培養(yǎng)的有樹鼩肺成纖維細胞[30]、脊髓星形膠質(zhì)細胞[31]、胸主動脈血管內(nèi)皮細胞[32]、小腸上皮細胞[33]、角膜內(nèi)皮細胞[34]、骨髓間充質(zhì)干細胞[35]和臍帶間充質(zhì)干細胞等[36]。其中比較有示范性的應用是干細胞治療，在國家科技支撐計劃項目(2014BAI01B00)支持下，解放軍昆明總醫(yī)院已建立樹鼩臍帶和骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離、培養(yǎng)、擴增和鑒定技術體系及規(guī)范，建成可儲存10 000份的干細胞種子資源庫，制備儲存樹鼩臍帶和骨髓間充質(zhì)干細胞2 000份；建立了樹鼩臍帶和骨髓間充質(zhì)干細胞體外轉(zhuǎn)GFP基因標記、BrdU標記、DAPI標記和順磁標記，為研究間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)的生物學行為提供了分析測試方法；以樹鼩代謝綜合征[37]、糖尿病[38]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型[39]為研究對象，進行了樹鼩臍帶間充質(zhì)干細胞的療效評價，為干細胞臨床療法提供了技術參考。

4 樹鼩標準化研究的意義與展望

樹鼩是我國特色動物資源，開展樹鼩的實驗動物化和種質(zhì)資源保存是一項國家戰(zhàn)略性任務，而建立標準化和規(guī)模化的樹鼩種質(zhì)資源基地，是實現(xiàn)其質(zhì)量標準化、生產(chǎn)規(guī)?；?、供應商品化和服務社會化的根本前提，具有重要應用價值和戰(zhàn)略意義。建立標準化樹鼩種質(zhì)資源，可有力促進其在生命科學領域的推廣應用，可為探討人類疾病致病機制和開發(fā)新型治療藥物等提供良好的實驗動物模型，滿足生命科學和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求，促成相關科學研究的重大突破。樹鼩種質(zhì)資源基地的建立及標準化研究技術體系和成果，可為我國其他實驗動物新品種的研發(fā)、保存和共享提供借鑒，共同促進我國實驗動物種質(zhì)資源保存工作的專業(yè)化和系統(tǒng)化。

未來樹鼩的標準化建設，要在地方樹鼩種質(zhì)資源基地的基礎上，逐步提升其規(guī)?；蜆藴驶剑粩嗤晟茦潼殬藴什⒅贫ㄆ鋰覙藴?，力爭建成國家級樹鼩種質(zhì)資源中心，同時積極開發(fā)適用于樹鼩實驗的檢測技術體系和試劑盒，加快推進樹鼩細胞資源庫的建設和轉(zhuǎn)基因樹鼩的研究。