鄧 鑫，任永申*，雷 蕾，鄭 堯，李 燕，廖矛川，鄧旭坤，張 萍

（1.中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430070； 2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心全軍中醫(yī)藥研究所，北京 100039）

痛經(jīng)分為原發(fā)性痛經(jīng)和繼發(fā)性痛經(jīng)，是未孕女性常見病，疼痛多持續(xù)1～3 d［1-2］，發(fā)生時通常伴有小腹脹痛、頭痛、背痛及乳房觸痛等癥狀［3］。原發(fā)性痛經(jīng)是由子宮收縮增強引起的經(jīng)期痙攣性疼痛，其特征為經(jīng)期疼痛無可見器質性病變，與正常排卵周期無關；繼發(fā)性痛經(jīng)即婦科疾病引起的經(jīng)期疼痛，常伴隨盆腔器官病變［4］。痛經(jīng)的發(fā)病率一般為50%～90%，由于環(huán)境和遺傳因素的影響，不同國家有所差異［1，3］。目前臨床上主要應用非甾體類抗炎藥、口服避孕藥緩解痛感或干擾發(fā)作［5-6］，但非甾體類抗炎藥作用寬泛，對其他系統(tǒng)（如肝臟、腎臟、消化道等）產(chǎn)生較大不良反應［7-8］；避孕藥也會產(chǎn)生惡心、水潴留、腦靜脈血栓、延遲排卵、降低雌激素和孕酮的循環(huán)水平、擾亂生理周期等不良反應［9-11］，因此有必要開發(fā)新藥物。中醫(yī)藥與民族醫(yī)藥在長期實踐中總結了豐富的婦科疾病治療、調理經(jīng)驗與有效藥物，對月經(jīng)不調、痛經(jīng)等療效顯著，被廣泛接受和應用［12-14］。復方竹節(jié)參顆粒由恩施土家醫(yī)治療婦科疾病的習用方開發(fā)而來，具有良好的抗痛經(jīng)作用，本實驗采用己烯雌酚和縮宮素誘導建立原發(fā)性痛經(jīng)體內(nèi)外模型，對其進行綜合評價并對其機制進行了初步探討。

1 材料

1.1 動物 SPF 級昆明種小鼠，體質量18～22 g，雌性未孕；SPF 級SD 大鼠，體質量200～220 g，雌性未孕，均由湖北省疾病預防控制中心提供，動物使用許可證號SYXK（鄂）2016-0089。

1.2 試劑與藥物 復方竹節(jié)參顆粒主要由竹節(jié)參、大血藤、延胡索、當歸、白芍、香附等藥材組成，采用水煎煮法提取并減壓干燥為浸膏（得率為35%），與1.5 倍量輔料（糊精-糖粉，比例1∶1）混合均勻，濕法制粒，干燥，即得，日用劑量為30 g；月月舒痛經(jīng)寶顆粒（仲景宛西制藥股份有限公司，批號161204）；己烯雌酚片（上海信誼康捷藥業(yè)有限公司，批號170109）；縮宮素注射液（哈爾濱摩天農(nóng)科獸藥有限公司，批號20170425）；氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責任公司，批號1611130801）。自配Locke’s 液（NaCl 9.2 g，KCl 0.42 g，無水CaCl20.24 g，NaHCO30.15 g，葡萄糖1.0 g，加超純水至1 000 mL）；前列腺素E2（PGE2）ELISA 檢測試劑盒（批號E20170601A）購自碧云天生物技術有限公司；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（批號20171213）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號20180412）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 DL28R 冷凍離心機（上海離心機械研究所）；CP214 分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；1510 全波長酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；PowerLab 生物信號采集系統(tǒng)（美國AD Instruments公司）；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；麥氏浴槽（沈陽萊博科貿(mào)有限公司）；S10 手提式組織勻漿器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 在體模型的建立及給藥

2.1.1 小鼠 取40 只雌性KM 小鼠（體質量18～22 g），隨機分成空白組、模型組、痛經(jīng)寶陽性對照組、復方竹節(jié)參顆粒（低、高）劑量組，每組8只，以己烯雌酚和縮宮素聯(lián)合復制小鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型。造模小鼠每天上午皮下注射己烯雌酚，空白組給予等體積生理鹽水，連續(xù)12 d。首日與末日己烯雌酚的給藥劑量為10 mg／kg；第2～11 天為5 mg／kg，給藥體積10 mL／kg，人工造成動物處于相同的動情期，以便于增強子宮平滑肌的敏感性；第12 天末次注射己烯雌酚1 h 后，腹腔注射20 U／kg縮宮素，引起小鼠子宮平滑肌強烈的痙攣性收縮產(chǎn)生疼痛，建成小鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型。第7 天開始灌胃給藥，連續(xù)5 d，空白組和模型組每天給予等體積超純水；參照《藥理實驗方法學（第4 版）》［15］劑量換算方法得到小鼠每日給藥劑量，痛經(jīng)寶陽性對照組為4.11 g／kg；復方竹節(jié)參顆粒低劑量組為6.17 g／kg（相當于人用劑量1 倍），高劑量組為18.50 g／kg（相當于人用劑量3 倍），各組灌胃給藥體積均為10 mL／kg。

2.1.2 大鼠 取40 只雌性SD 大鼠（體質量200～220 g），隨機分成空白組、模型組、痛經(jīng)寶陽性對照組、復方竹節(jié)參顆粒（低、高）劑量組，每組8只。以己烯雌酚和縮宮素聯(lián)合復制小鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型。于每日上午皮下注射己烯雌酚，空白組給予等體積生理鹽水，連續(xù)12 d。首日與末日己烯雌酚的給藥劑量為5 mg／kg，第2～11 天為2.5 mg／kg，給藥體積10 mL／kg，人工造成動物處于相同的動情期，以便于增強子宮平滑肌的敏感性。第12 天末次注射己烯雌酚1 h 后，腹腔注射10 U／kg 縮宮素，引起大鼠子宮平滑肌強烈的痙攣性收縮產(chǎn)生疼痛，建成大鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型。第7 天開始灌胃給藥，連續(xù)5 d，空白組和模型組每天給予等體積超純水；依據(jù)《藥理實驗方法學（第4 版）》［15］劑量換算方法得到大鼠每日給藥劑量，痛經(jīng)寶陽性對照組為1.87 g／kg；復方竹節(jié)參顆粒低劑組為2.80 g／kg（相當于人用劑量1 倍），高劑組為8.41 g／kg（相當于人用劑量3 倍），各組灌胃給藥體積均為10 mL／kg。

2.1.3 表觀指標檢測 己烯雌酚和縮宮素建模成功后，觀察并記錄各組動物的行為反應（注射縮宮素后10 min 內(nèi)）、飲食、精神狀態(tài)、毛色、被毛光澤度等作為痛經(jīng)表觀指標，根據(jù)表1 標準進行評分。

表1 痛經(jīng)動物模型的表觀指標得分Tab.1 Scores of apparent indexes for animal models of dysmenorrhea

2.1.4 痛經(jīng)指標檢測 建模成功后，分別記錄30 min內(nèi)KM 小鼠、SD 大鼠的扭體潛伏期和扭體次數(shù)，不發(fā)生扭體反應的潛伏期按30 min 計；記錄注射縮宮素后30 min 內(nèi)痛經(jīng)動物的扭體次數(shù)并計算其扭體抑制率，公式為扭體抑制率＝［（模型組扭體次數(shù)均值－給藥組扭體次數(shù)均值）／模型組扭體次數(shù)均值］×100%。

2.1.5 生化指標檢測 測完扭體次數(shù)后，將各組動物脫頸處死，迅速剝離右側子宮組織，剔除結締組織，生理鹽水洗凈，拭干，稱取同一位置子宮500 mg，冰浴下加入1.5 mL 生理鹽水制備勻漿，4 ℃、3 000 r／min 離心15 min，取上清液，測定子宮勻漿PGE2、NO、MDA 水平（按試劑盒說明書操作）。

2.2 大鼠離體痛經(jīng)模型的建立及給藥 取24 只體質量200～220 g 健康未孕雌性SD 大鼠，隨機分為4 組，于實驗前3 d 每天腹腔注射2 mg／kg 己烯雌酚，以提高子宮的敏感性。末次腹腔注射給藥2 h后，頸椎脫臼法處死大鼠，剖開腹腔，取同側子宮，去除卵巢和子宮角部位并剝離子宮上附著的脂肪等結締組織，將子宮兩端結扎，其中一端用絲線結扎子宮角側末端，長度（2.0±0.1）cm，子宮頸端用絲線固定于浴槽底端掛鉤上，置于含充有飽和空氣（通入速度為1～2 個氣泡／s）的Locke’s液的恒溫浴槽中，卵巢端連接于張力換能器，并將后者連接于多道信號采處理系統(tǒng)，調節(jié)螺母使標本前負荷2 g，控制Locke’s液溫度（37.0±0.5）℃。開啟生理信號采集系統(tǒng)，平衡30 min，待子宮平滑肌自發(fā)性收縮平穩(wěn)、自發(fā)節(jié)律恢復后開始實驗。

各組加入縮宮素（終濃度5 U／L），記錄15 min子宮收縮張力曲線后分別加入藥液。模型組給予等體積超純水，痛經(jīng)寶陽性對照組、復方竹節(jié)參顆粒低劑組、復方竹節(jié)參顆粒高劑組終質量濃度分別為60、90、270 mg／L，記錄給藥后15 min 內(nèi)的子宮平滑肌收縮張力并計算抑制率，公式為收縮張力抑制率＝［（給藥前平均張力－給藥后平均張力）／給藥前平均張力］×100%。

2.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 對在體原發(fā)性痛經(jīng)模型動物表觀指標的影響 如表2 所示，與空白組比較，模型組得分降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組得分增加（P＜0.05，P＜0.01），以復方竹節(jié)參顆粒低劑組、痛經(jīng)寶陽性對照組較高，提示復方竹節(jié)參顆粒能顯著緩解由縮宮素引起的痛經(jīng)癥狀，并且在正常劑量（低劑量）下使用效果更好。

表2 復方竹節(jié)參顆粒對原發(fā)性痛經(jīng)在體動物模型表觀指標的影響（±s，n＝8）Tab.2 Effects of FZGs on indexes for presented multiple symptoms in animal models of primary dysmenorrhea（±s，n＝8）

表2 復方竹節(jié)參顆粒對原發(fā)性痛經(jīng)在體動物模型表觀指標的影響（±s，n＝8）Tab.2 Effects of FZGs on indexes for presented multiple symptoms in animal models of primary dysmenorrhea（±s，n＝8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 對原發(fā)性痛經(jīng)模型動物痛經(jīng)指標的影響 如表3 所示，與空白組比較，模型組動物潛伏期降低，扭體次數(shù)升高（P＜0.01）；與模型組比較，痛經(jīng)寶陽性對照組、復方竹節(jié)參顆粒組可不同程度地延長扭體潛伏期，減少扭體次數(shù)（P＜0.05，P＜0.01）。從扭體抑制率來看，復方竹節(jié)參顆粒組低劑量抑制作用較強，提示該藥在正常劑量下可產(chǎn)生良好的緩解痛經(jīng)的作用。

表3 復方竹節(jié)參顆粒對原發(fā)性痛經(jīng)在體動物模型痛經(jīng)指標的影響（±s，n＝8）Tab.3 Effects of FZGs on dysmenorrhea indexes in animal models of primary dysmenorrhea in vivo（±s，n＝8）

表3 復方竹節(jié)參顆粒對原發(fā)性痛經(jīng)在體動物模型痛經(jīng)指標的影響（±s，n＝8）Tab.3 Effects of FZGs on dysmenorrhea indexes in animal models of primary dysmenorrhea in vivo（±s，n＝8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃ P＜0.01。

3.3 對在體原發(fā)性痛經(jīng)模型動物子宮勻漿中生化指標的影響 與空白組比較，模型組子宮組織中PGE2、NO 水平下降，MDA 水平增加（P＜0.01）；與模型組比較，復方竹節(jié)參顆粒組可升高子宮組織中PGE2、NO 水平，降低MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01），提示復方竹節(jié)參顆粒在正常劑量（低劑量）下即可對婦科疾?。ㄍ唇?jīng)）產(chǎn)生較好的調經(jīng)止痛作用。見表4。

表4 復方竹節(jié)參顆粒對原發(fā)性痛經(jīng)在體動物模型生化指標的影響（±s，n＝8）Tab.4 Effects of FZGs on biochemical indexes in animal models of primary dysmenorrhea in vivo（±s，n＝8）

表4 復方竹節(jié)參顆粒對原發(fā)性痛經(jīng)在體動物模型生化指標的影響（±s，n＝8）Tab.4 Effects of FZGs on biochemical indexes in animal models of primary dysmenorrhea in vivo（±s，n＝8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 對離體原發(fā)性痛經(jīng)模型動物指標的影響 采用己烯雌酚和縮宮素制備大鼠離體原發(fā)性痛經(jīng)模型，經(jīng)給藥后，與建模后張力（0～15 min）比較，各組給藥后張力降低；與模型組比較，復方竹節(jié)參顆粒低劑組、痛經(jīng)寶陽性對照組收縮張力抑制率增加（P＜0.01），提示復方竹節(jié)參顆粒在正常劑量（低劑量）下對離體子宮平滑肌收縮即可產(chǎn)生較好的抑制作用，與體內(nèi)實驗結果相吻合。見圖1、表5。

表5 復方竹節(jié)參顆粒對原發(fā)性痛經(jīng)離體大鼠子宮平滑肌收縮張力的影響（±s，n＝6）Tab.5 Effects of FZGs on contraction tension of isolated uterine smooth muscle in rats of primary dysmenorrhea（±s，n＝6）

表5 復方竹節(jié)參顆粒對原發(fā)性痛經(jīng)離體大鼠子宮平滑肌收縮張力的影響（±s，n＝6）Tab.5 Effects of FZGs on contraction tension of isolated uterine smooth muscle in rats of primary dysmenorrhea（±s，n＝6）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

4 討論

痛經(jīng)是女性最常見的婦科疾病之一，發(fā)生時通常出現(xiàn)下腹部疼痛、腹瀉、腰酸膝軟、股腹溝疼痛、頭痛等癥狀，根據(jù)是否伴隨盆腔病變可分為原發(fā)性痛經(jīng)和繼發(fā)性痛經(jīng)，其中前者是月經(jīng)期由于子宮收縮增強引起的痙攣性疼痛，其特征為無可見器質性病變，與正常排卵周期無關。己烯雌酚是一種合成的非甾體雌激素，可通過質膜上的細胞外相互作用引起內(nèi)皮剝脫的大鼠主動脈平滑肌的急劇松弛［16］，連續(xù)皮下注射后可提高動物子宮的敏感性，出現(xiàn)平滑肌松弛，使動物處于相同的動情期；腹腔注射縮宮素時，可使動物產(chǎn)生類似痛經(jīng)癥狀?，F(xiàn)代研究表明，采用己烯雌酚和縮宮素可以較好地模擬原發(fā)性痛經(jīng)癥狀［17］。

復方竹節(jié)參顆粒為恩施土家醫(yī)臨床治療婦科疾病（痛經(jīng)、月經(jīng)不調等）的習用方，主要由白三七、紅藤、延胡索、當歸、白芍、香附等藥材組成，具有較好的治療痛經(jīng)、月經(jīng)不調等婦科疾病的療效。痛經(jīng)寶顆粒主要由紅花、當歸、肉桂、三棱等9 味藥材組成，為歷版《中國藥典》所收載，主要用于寒凝氣滯血瘀婦女痛經(jīng)等癥狀，療效較為顯著，是臨床應用較為廣泛的中藥治療痛經(jīng)成方制劑。為客觀評價復方竹節(jié)參顆粒治療痛經(jīng)的作用，本研究將痛經(jīng)寶顆粒作為陽性對照，采用己烯雌酚和縮宮素建立在體、離體原發(fā)性痛經(jīng)模型。

表觀指標可以間接反應動物痛經(jīng)模型疼痛情況，是評價痛經(jīng)程度的重要指標。治療后，各給藥組得分明顯增加，其中以復方竹節(jié)參顆粒低劑組表觀得分最高，提示它能顯著緩解由縮宮素引起的痛經(jīng)癥狀。扭體潛伏期、扭體次數(shù)、扭體抑制率是評價痛經(jīng)反應的重要指標，可以判斷模型制備是否成功、藥物鎮(zhèn)痛作用強弱。建立在體原發(fā)性痛經(jīng)模型后與空白組比較，模型組扭體潛伏期縮短，扭體次數(shù)顯著增加，提示原發(fā)性痛經(jīng)模型建立成功；與模型組比較，各給藥組不同程度延長了扭體潛伏期、減少扭體次數(shù)，扭體抑制率依次為復方竹節(jié)參顆粒低劑組＞痛經(jīng)寶陽性藥組＞復方竹節(jié)參顆粒高劑組，提示復方竹節(jié)參顆粒具有較好的抑制痛經(jīng)的作用，并且在正常劑量（低劑量）下即可產(chǎn)生良好的緩解痛經(jīng)的作用。

PGE2、NO、MDA 是動物痛經(jīng)模型疼痛過程機體反應的常用指標，也是藥物鎮(zhèn)痛作用的重要臨床指標?，F(xiàn)代研究證實，痛經(jīng)患者子宮內(nèi)膜和月經(jīng)血中前列腺素（PG）水平明顯高于正常人群，PG 包括PGF2α 和PGE2，PGE2可抑制子宮平滑肌自發(fā)收縮，而PGF2α促使子宮平滑肌收縮，故痛經(jīng)發(fā)生時患者子宮內(nèi)膜和月經(jīng)血中PGF2α水平明顯升高，PGE2水平則降低［18］。NO 可通過NO-cGMP 途徑表現(xiàn)出致痛和鎮(zhèn)痛雙重作用，主要參與外周及中樞水平的痛覺調制，當作用于外周調制時其水平升高，可放松子宮平滑肌以緩解痛經(jīng)［13，19-20］。痛經(jīng)發(fā)生時，由于子宮缺血可導致過多的脂質過氧化和氧化應激［21］，MDA 是脂質過氧化的最終產(chǎn)物，它反映了脂質過氧化的程度［22］。建模后與空白組比較，模型組PGE2、NO 水平降低，MDA 水平升高；與模型組比較，各給藥組能不同程度升高PGE2、NO水平，降低MDA 水平，以復方竹節(jié)參顆粒低劑組效果最好，提示它在正常劑量（低劑量）下使用時，可能通過增加PGE2水平抑制子宮平滑肌自發(fā)收縮，升高NO 水平以放松子宮平滑肌，減少脂質過氧化產(chǎn)物MDA 水平來達到緩解痛經(jīng)的作用。

己烯雌酚和縮宮素制備大鼠離體原發(fā)性痛經(jīng)模型后，模型組子宮平滑肌收縮張力增加，給藥后各組子宮收縮張力減小，抑制率依次為復方竹節(jié)參顆粒低劑組＞痛經(jīng)寶陽性藥組＞復方竹節(jié)參顆粒高劑組，提示復方竹節(jié)參顆粒在低劑量下對離體子宮平滑肌收縮可以產(chǎn)生較好的抑制作用，與在體實驗結果相吻合。此外，本研究發(fā)現(xiàn)復方竹節(jié)參顆粒在正常劑量下產(chǎn)生良好的緩解痛經(jīng)作用，而在高劑量下（日用劑量3 倍）反而減弱，動物表觀指標降低，提示其不可過量使用，可能與過度調節(jié)機體、子宮狀態(tài)有關。

本實驗從民族醫(yī)學習用方中發(fā)現(xiàn)復方竹節(jié)參顆粒，并進行了產(chǎn)品開發(fā)和體內(nèi)外藥效學研究，顯示該藥物具有良好的抗痛經(jīng)作用，為其開發(fā)提供了科學依據(jù)，也為其他民族藥物相關研究提供了參考經(jīng)驗。