蔡蕭君，頡彥鵬，胡 楊，劉 松，王 磊

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150036）

抑郁癥是一種情緒低落、對(duì)活動(dòng)反感的狀態(tài)，常會(huì)干擾患者日常生活，給患者及其家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1]。然而，由于抑郁癥發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，其病因仍不清楚[2]。與合成抗抑郁藥相比，中藥在疾病的預(yù)防和治療中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樗牟涣挤磻?yīng)相對(duì)較少，安全性更高[3]。桔梗是一種傳統(tǒng)的中藥，已被廣泛用于治療痰多、咳嗽、咽喉痛[4-6]。此外，桔梗葉還含有豐富的化學(xué)成分，如必需氨基酸，特別是谷氨酸和精氨酸、膳食纖維和礦物質(zhì)、多酚、三萜皂苷、酚酸、聚乙炔、甾醇和類黃酮[6-9]。同時(shí)，桔梗葉還可通過(guò)改善H22荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。

代謝組學(xué)被認(rèn)為是探索含有多種生物化學(xué)成分的藥物潛在機(jī)制的有力工具，它提供了可能構(gòu)成病理生理狀態(tài)的多種生化途徑的總體概述，因此，有利于抑郁癥等多功能疾病的研究。本研究采用代謝組學(xué)方法，研究了桔梗葉對(duì)脂多糖刺激小鼠模型的抗抑郁作用，并驗(yàn)證了其潛在的生物標(biāo)志物及相關(guān)的代謝途徑，以期為桔梗的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 Ekspert ultra LC100液相色譜儀、ABSciex Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀（美國(guó)ABSciex集團(tuán)公司）；Progenesis QI（美國(guó)Waters集團(tuán)公司）；KDC-160HR型高速低溫離心機(jī)（中國(guó)科大創(chuàng)新股份公司）；桔梗葉采自吉林省，經(jīng)蔡蕭君教授鑒定為正品。將桔梗葉風(fēng)干、研磨并過(guò)篩（40目）以獲得均勻粉末。然后用70%甲醇在80℃下（每次3 h）萃取粉末3次。過(guò)濾后，將提取液合并濃縮蒸發(fā)得到桔梗葉提取物；乙腈和甲醇為超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）級(jí)（比利時(shí)費(fèi)希爾化工公司）；甲酸（美國(guó)Sigma Aldrich公司）；去離子水（中國(guó)A.S.Watson集團(tuán)有限公司）；脂多糖購(gòu)自Sigma Aldrich（批號(hào)：20171102）。白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)（ELISA）定試劑盒購(gòu)自美國(guó)明尼阿波利斯研發(fā)系統(tǒng)有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建城生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物 雄性7月齡ICR小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供[SCXK（遼）2019-0001]。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)及樣本制備 16只ICR小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為2組，即模型組和給藥組。另選8只同批次健康小鼠作為空白組。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d（溫度 21～23℃，相對(duì)濕度 45%±5%，12 h光/暗循環(huán)，光循環(huán)從早上7∶00開(kāi)始），實(shí)驗(yàn)期間自由飲食和飲水，給藥組灌胃給予桔梗葉提取液進(jìn)行干預(yù)[400 mg/（kg·d），連續(xù)1周?？瞻捉M與給藥組第1天至第4天腹腔注射等體積無(wú)菌生理鹽水，每日1次，模型組在第4天注射生理鹽水后，腹腔注射脂多糖（0.5 mg/kg）建立抑郁模型[10]。實(shí)驗(yàn)第8天收集12 h尿液，離心（4℃、11 000 r/min、12 min），取上清液置于-80℃環(huán)境下保存，尿液代謝樣本采取原尿液，離心（4℃、11000r/min、12min），過(guò)0.22μm 濾膜作為供試品溶液。實(shí)驗(yàn)第8天摘眼球取血，4℃下凝固1 h，在3 500 r/min離心15 min，在4℃下獲得血清。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，取腦組織，分離前額葉皮質(zhì)，制備組織勻漿，低溫離心（4℃，10 000 r/min，5 min）保存待測(cè)。

1.4 前額葉皮質(zhì)炎癥因子IL-6、TNF-α的檢測(cè)操作步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn) 采用蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠抑郁模型是否如前所述成功建立。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將剝奪12 h飲水的小鼠置于兩瓶預(yù)先稱質(zhì)量的1%蔗糖水中。12 h后，取下兩瓶并稱質(zhì)量，計(jì)算蔗糖水的消耗量。蔗糖偏好是蔗糖溶液消耗量相對(duì)于總液體消耗量的百分比。公式如下：蔗糖偏好=[蔗糖攝入量/（蔗糖消耗量+水消耗量）]100%。

1.6 代謝組學(xué)分析條件 采用Acquity UPLCBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）色譜柱進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相A（0.1%甲酸水）、流動(dòng)相B（0.1%甲酸乙腈），流速設(shè)為 0.4 mL/min。洗脫條件為：0～2 min，10%B；2～26 min，10%～90%B；26～28 min，90%B；28～28.1 min，90%～10%B。UPLC柱的溫度設(shè)置為30℃，樣品的溫度為10℃。分別使用1/1和9/1的水/乙腈混合物作為弱洗滌溶劑和強(qiáng)洗滌溶劑。

超高效液相飛行（UPLC-QTOF）質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）continuum模式采集代謝數(shù)據(jù)。陽(yáng)離子模式條件為：毛細(xì)管電壓3.0kV，錐電壓40 V，離子源溫度150℃，脫溶溫度580℃，錐孔氣流量50L/h，脫溶劑氣流量800 L/h，掃描范圍100～1 200 Da，負(fù)離子模式毛細(xì)管電壓為2.2 kV。碰撞能量為20～40 V。在單次LC運(yùn)行期間，通過(guò)質(zhì)譜儀快速?gòu)牡团鲎材芰繏呙枨袚Q到高碰撞能量掃描來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。Leucine encephalin用作鎖定噴頭的外部參考。

1.7 數(shù)據(jù)處理 本部分高通量代謝數(shù)據(jù)采用Progenesis QI 1.0軟件（美國(guó)Waters公司）進(jìn)行處理，首先對(duì)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，獲取的代謝數(shù)據(jù)中與抑郁癥最相關(guān)的生物信息數(shù)據(jù)學(xué)數(shù)據(jù)。然后生成臨時(shí)文件用于化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，采用主成分分析或偏最小二乘判別分析的理論算法篩選組間差異離子，通過(guò)第三方數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)最終確定潛在生物標(biāo)記物。本部分組間差異離子篩選標(biāo)準(zhǔn)為S-plot圖中遠(yuǎn)離中心原點(diǎn)，且TTEST值小于0.05的離子作為差異離子。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS23.0軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)結(jié)果 炎癥一直被認(rèn)為是抑郁癥的潛在病理生理因素之一[11]。在小鼠接受脂多糖刺激后，與空白組相比，IL-6和TNF-α濃度顯著升高，與模型組相比，給藥組血清IL-6和TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。此外，與空白組相比，模型組海馬組織SOD活性顯著降低，給藥組海馬組織SOD活性顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖 1。

2.2 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白組相比，模型組在蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)中消耗更少的蔗糖，見(jiàn)圖2。這表明該模型建立良好，小鼠表現(xiàn)出抑郁相關(guān)的無(wú)核細(xì)胞減少和食欲不振癥狀，而與模型組相比，桔梗葉提取物干預(yù)明顯增加了蔗糖偏好。

2.3 尿液代謝組學(xué)研究 空白組、脂多糖誘導(dǎo)的模型組和給藥組在ESI+和ESI-的模式下均能通過(guò)主成分分析得分圖清楚地觀察到給藥組位于模型組和空白組之間，傾向于空白組，這表明模型中的特定生物標(biāo)志物發(fā)生了變化，而桔梗葉治療對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的代謝紊亂有顯著的調(diào)節(jié)作用。如圖3所示，正交偏最小二乘判別分析評(píng)分圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本。生成S圖以識(shí)別潛在代謝物。S-plot可用于可視化代謝物和模型類之間的協(xié)方差和相關(guān)性，在正交偏最小二乘判別分析模型下，生成S圖，從統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物化學(xué)角度識(shí)別潛在代謝物，這有助于篩選組間差異變量。在S圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)化合物。S圖中的點(diǎn)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，它們對(duì)空白組和模型組的聚類作用越顯著，筆者采用此方法共選擇29種內(nèi)源性代謝物作為潛在的生物標(biāo)志物。見(jiàn)表1。

采用Simca處理數(shù)據(jù)后，列出檢測(cè)到的所有峰強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的m/z-Rt值。用高精度準(zhǔn)分子離子計(jì)算生物標(biāo)志物的可能分子式，其質(zhì)量耐受性在ppm以內(nèi)。將從10～40 eV獲得的匹配組分的MS/MS片段與梅特林的片段進(jìn)行比較。將參考物質(zhì)與保留時(shí)間、m/z和MS碎片模式進(jìn)行比較，最終確定了潛在的生物標(biāo)志物。相同的Rt、m/z值和相似的碎片被認(rèn)為屬于同一組分。然后，利用生物化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，包括HMDB （http：//www.hmdb.ca/）、Metlin（http：//metlin.scrips.edu/）、KEGG（http：//www.kegg.com/）和Metaboanalyst 4.0（http：//www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)一步鑒定潛在的生物標(biāo)志物。根據(jù)代謝分析數(shù)據(jù)，選擇影響值閾值在0.10以上的代謝途徑作為最有潛力的代謝途徑[12]。見(jiàn)圖4-5。

圖1 抑郁癥小鼠生化指標(biāo)結(jié)果（x±s）Fig.1 Resultsof biochemical indexesin depressed mice（x±s）

圖2 抑郁癥小鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）Fig.2 Experimental results of sugar water preference in depressed mice（x±s）

3 討論

圖3 空白組、模型組及給藥組的PCA得分圖及S-plotFig.3 PCA score plot and s-plot of blank group，model group and drug administration group

桔梗葉的抗抑郁作用與脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、能量代謝、花生四烯酸代謝、谷胱甘肽代謝、肌醇磷酸酯代謝等代謝途徑的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在目前的研究中，代謝組學(xué)與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合，有助于了解與脂多糖誘導(dǎo)的抑郁癥有關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，以及在桔梗葉治療后對(duì)生物標(biāo)志物代謝偏差的調(diào)節(jié)。29種代謝產(chǎn)物，與模型組相比有顯著變化，被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物，可通過(guò)桔梗葉治療進(jìn)行調(diào)節(jié)，提示桔梗葉對(duì)抑郁癥有治療作用，而所發(fā)現(xiàn)的代謝物可作為后續(xù)研究的潛在目標(biāo)。

表1 抑郁癥小鼠尿液生物標(biāo)志物表Tab.1 Urinebiomarkersof depressed mice

圖4 基于Metaboanalyst的代謝通路富集分析Fig.4 Metabolic pathway enrichment analysisbased on Metaboanalyst

圖5 抑郁癥小鼠模型尿液代謝通路圖Fig.5 Urine metabolic pathway map in mice model of depression

脂多糖誘導(dǎo)抑郁模型被廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥物的活性評(píng)價(jià)。動(dòng)物的行為[10，13]、炎癥[12-16]和氧化應(yīng)激[17]反應(yīng)都是評(píng)價(jià)抗抑郁藥作用的重要因素。體質(zhì)量、蔗糖偏好、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和尾懸實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)時(shí)間以及IL-6、TNF-α和SOD水平是常用的指標(biāo)[10]。本研究證實(shí)了桔梗葉對(duì)脂多糖誘導(dǎo)抑郁癥模型的抗抑郁作用，結(jié)果表明，桔梗葉干預(yù)能顯著提高蔗糖偏好，降低促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平，提高SOD水平。筆者推測(cè)桔梗葉的抗抑郁作用與抗炎和抗氧化活性有關(guān)?；赨PLC-Q/TOF-MS的代謝組學(xué)研究結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)一步說(shuō)明了桔梗葉的抗抑郁作用。筆者發(fā)現(xiàn)了29個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，它們與抑郁癥的關(guān)系分析如下。

3.1 脂質(zhì)代謝 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磷脂代謝（SPHM）、甘油磷脂代謝（GLYM）和亞油酸代謝（LINM）均參與了桔梗葉的治療作用，模型組血清肌醇鞘蛋白、鞘氨醇、磷酸鞘氨醇、乳糖神經(jīng)酰胺和SM均降低，提示抑郁癥可引起代謝擾動(dòng)，這與先前的研究一致[18-20]。SM（d18∶0/16∶1）可誘發(fā)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的突觸異常[20-21]，此類鞘脂在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，對(duì)多種腦功能至關(guān)重要。它們的上調(diào)表明了桔梗葉的抗抑郁作用。其次，模型組膽堿類成分和溶血酶水平降低，甘油磷酸膽堿水平升高，說(shuō)明代謝異常在脂多糖誘導(dǎo)的抑郁癥中起著重要作用。據(jù)報(bào)道，包括膽堿和溶血酶在內(nèi)的甘油磷酸脂與包括抑郁癥在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[22-23]。膽堿是細(xì)胞膜中含量最豐富的磷脂，通過(guò)改變線粒體脂質(zhì)分布影響抑郁癥的發(fā)展[22，24]。它們的改變也表明了桔梗葉的抗抑郁作用。膽堿是亞油酸代謝的重要代謝產(chǎn)物，在抑郁癥中起著重要作用[25-26]。以往的研究表明，亞油酸及其衍生物12，13-環(huán)氧乙烷可能影響抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展，這與筆者的研究結(jié)果一致，結(jié)果提示脂質(zhì)代謝的改變與桔梗葉的抗抑郁作用之間存在著重要的聯(lián)系。

3.2 氨基酸代謝 氨基酸在生物體的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，色氨酸可以通過(guò)血液輸送到大腦[26]，色氨酸作為 5-羥色胺（5-HT）的前體，在抑郁癥的發(fā)展中起著重要作用[27-28]。本研究中模型組血清中色氨酸和吲哚乙醛含量顯著降低，提示色氨酸代謝失衡，色氨酸轉(zhuǎn)化率降低，從而影響小鼠體內(nèi)5-HT含量。然而，觀察到桔梗葉能阻止這兩種代謝產(chǎn)物的還原傾向，提示了桔梗葉的治療作用。

3.3 能量代謝 能量缺乏在抑郁癥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[29]。三羥酸循環(huán)（TCA）通過(guò)將乙酰輔酶A氧化為化學(xué)能和所有有氧生物的二氧化碳來(lái)釋放儲(chǔ)存的能量[30]。長(zhǎng)期以來(lái)，乙酰輔酶A一直被認(rèn)為是許多生物生化反應(yīng)不可或缺的輔助因子[31]，泛酸是輔酶A的前體，通過(guò)增加乙酰輔酶A水平、抑制炎癥和氧化應(yīng)激，可能有助于抑制抑郁過(guò)程[32]。此外，2-氧代戊二酸[33]、檸檬酸和酮戊二酸[34]也與抑郁癥有關(guān)。在本研究中，觀察到單用脂多糖刺激后，酮戊二酸、檸檬酸和泛乙胺磷酸酯的降低和泛酸的增加，這些都可以通過(guò)桔梗葉的干預(yù)產(chǎn)生改變。

3.4 其他代謝 據(jù)報(bào)道，炎癥與腫瘤和抑郁癥等多種疾病的發(fā)病有關(guān)[35-36]。花生四烯酸代謝在炎癥反應(yīng)的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[37]，并與抑郁癥關(guān)系密切，當(dāng)人體受到刺激時(shí)，花生四烯酸被水解釋放，產(chǎn)生多種活性物質(zhì)。其中，花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧化酶產(chǎn)生白三烯A4，白三烯A4水解酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為白三烯B4。本研究在模型組中觀察到白三烯A4、19（S）-HETE、花生四烯酸、20-羥基丁三烯B4水平升高，說(shuō)明花生酸代謝不平衡可能是抑郁癥的癥狀。同時(shí)，給藥組上述代謝物水平降低，說(shuō)明桔梗葉干預(yù)了抑郁反應(yīng)，抑制了代謝紊亂。

谷胱甘肽（GSH）可以防止某些含硫醇的蛋白質(zhì)或酶受到過(guò)氧化物等氧化劑的損害[38]，研究表明，谷胱甘肽可能是疾病早期嚴(yán)重抑郁癥的潛在標(biāo)志物[39]。筆者觀察到模型組GSH降低，給藥組GSH升高，這與SOD的變化趨勢(shì)一致，表明氧化應(yīng)激是抑郁癥發(fā)病的重要因素，而桔梗葉具有調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化的作用。肌醇被認(rèn)為是一種神經(jīng)膠質(zhì)特異性標(biāo)記物，前期研究報(bào)道，抑郁癥患者腦內(nèi)前額皮質(zhì)和海馬的肌醇共振降低[40]，并且在飲食中加入肌醇可以減輕抑郁[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑郁小鼠血清中肌醇含量低，給予桔梗葉提取物后上調(diào)，說(shuō)明桔梗葉提取物的抗抑郁作用與上述代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

綜述所述，桔梗葉提取物對(duì)抑郁小鼠具有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)亞油酸、花生三烯醇等的代謝密切相關(guān)。