鐘芳芳，嚴(yán)鳴光，楊 芳，朱 格，殷衛(wèi)兵

（商丘市第一人民醫(yī)院，商丘 476100）

老年性癡呆（阿爾茨海默病，AD）是一種常發(fā)生于老年期，以記憶缺失，進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。目前認(rèn)為AD主要的病理學(xué)改變?yōu)樯窠?jīng)原纖維纏結(jié)、老年斑和大量的神經(jīng)元丟失[2]。近年來，隨著人均壽命的逐漸增加和人口老齡化日益嚴(yán)重，AD已成為繼心血管疾病、腫瘤和中風(fēng)之后的第4大死亡原因[3]。AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來研究顯示AD與膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、炎癥和氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[4]。目前醫(yī)學(xué)界對AD的防治尚無理想藥物。桑辛素是桑葉中的一種分子量為420.461的黃酮類化合物，研究表明其具有抗炎、抗衰老、抗菌、抗病毒和降血糖等廣泛的藥理作用[5]。它的抗炎機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，而抗衰老機(jī)制則與其可清除氧自由基作用有關(guān)。目前桑辛素對老年性癡呆的研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究旨在探討桑辛素對老年性癡呆的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為桑辛素的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 桑辛素：含量≥98%，上海士鋒生物科技有限公司，批號：62596-29-6；D-半乳糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20160714；吡拉西坦片：規(guī)格：0.4 g/片，湖北華中藥業(yè)有限公司，批號：20160830。乙酰膽堿（ACH）、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20170620、20170511。白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒：博士德生物技術(shù)有限公司，批號：20170221、20170421；蘇木精-伊紅（HE）染液，南京建成科技有限公司，批號：20170412。p53鼠多克隆抗體：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：20170405。

1.2 動物 SPF級Balb/c小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量為20～24 g，購買于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號為SCXK（粵）2016-0003。飼養(yǎng)條件：相對濕度為50%～70%，溫度為21～23℃，明暗各12 h。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與給藥 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組、模型組、吡拉西坦組（PRT）、桑辛素低劑量組（MRS-L組）、桑辛素中劑量組（MRS-M組）、桑辛素高劑量組（MRS-H組），每組10只。連續(xù)8周皮下注射D-半乳糖100 mg/（kg·d）造模，造模當(dāng)天開始連續(xù)給藥8周，其中PRT組灌胃給藥0.75 g/（kg·d），桑辛素低、中、高劑量組分別灌胃給藥10、20、40mg/（kg·d），空白對照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.3.2 Morris水迷宮 實(shí)驗(yàn)方法主要參照文獻(xiàn)[6]，具體實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分，定位航行實(shí)驗(yàn)：每次實(shí)驗(yàn)將小鼠分別從1、3、4象限中點(diǎn)放入水池，記錄小鼠找到平臺的時(shí)間，即為潛伏期，假如小鼠在1 min內(nèi)仍未找到平臺，需引導(dǎo)小鼠到平臺上停留25 s，并記錄其潛伏期按1min，連續(xù)4 d。第5天撤掉平臺，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠60 s內(nèi)通過平臺的次數(shù)以及分析小鼠尋找平臺的策略。

1.3.3 腦組織海馬齒狀回結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化 4%多聚甲醛固定腦組織，自來水流水沖洗24 h，75%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片和常規(guī)HE染色，片厚為5μm，觀察腦組織海馬齒狀回結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化。

1.3.4 生化指標(biāo)檢測 采用ELISA檢測方法檢測血清TNF-α和IL-1β的含量。取腦組織，制成10%勻漿，測定ChAT活性和ACH含量。實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.3.5 p53蛋白表達(dá)的檢測 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法，首先采用二喹啉甲酸（BCA）法定量檢測腦組織勻漿蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離目的蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉4 h，分別加入一抗（1∶900）和內(nèi)參 β-action（1∶4 000），4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶4 000），ECL試劑盒顯色檢測蛋白條帶。以β-action灰度值作為內(nèi)參照，采用quantity one Image J軟件進(jìn)行圖像灰度值分析。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，各組不同時(shí)點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法，分別通過定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分，檢測各組小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和空間探索能力。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠尋找到平臺的潛伏期顯著延長（P＜0.05或 P＜0.01），穿越平臺所在位置的次數(shù)顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），探索策略也多采用趨向式。與模型組比較，PRT組和桑辛素給藥組小鼠找到平臺的潛伏期均顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01），穿越平臺所在位置的次數(shù)顯著增多（P＜0.05或 P＜0.01），探索策略也多采用直線式。與MRS-L組比較，MRS-H組和PRT組小鼠找到平臺的潛伏期均顯著降低（P＜0.05），穿越平臺所在位置的次數(shù)顯著增多（P＜0.05），探索策略采用直線式較多。見表1-2。

表1 各組小鼠空間學(xué)習(xí)能力結(jié)果（x±s）Tab.1 Resultsof space learning capability of mice in each group（x±s）

表2 各組小鼠空間探索能力結(jié)果（x±s）Tab.2 Results of space exploration capability of mice in each group（x±s）

2.2 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠腦組織海馬齒狀回結(jié)構(gòu)的影響 本實(shí)驗(yàn)通過石蠟切片、HE染色方法觀察各組小鼠腦組織海馬齒狀回病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，空白對照組海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，飽滿，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰。模型組海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞排列散亂，胞漿濃縮，核固縮，而PRT組和MRT給藥組神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況明顯改善。見圖1。

2.3 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠血清TNF-α和IL-1β含量的影響 本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測方法，分別檢測各組小鼠血清TNF-α和IL-1β含量。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α和IL-1β含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，PRT組和MRS給藥組小鼠血清TNF-α和IL-1β 含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與 MRS-L組比較，MRS-H組和PTR組小鼠血清TNF-α和IL-1β 含量明顯降低（P＜0.05）。見圖 2-3。

2.4 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠腦組織ChAT活性和ACH含量的影響 本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測方法，分別檢測各組小鼠腦組織ChAT活性和ACH含量。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠腦勻漿ChAT活性和ACH含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，MRS-M組和MRS-H組小鼠腦勻漿ChAT活性和ACH含量明顯升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。見圖 4-5。

圖1 各組小鼠腦組織海馬齒狀回結(jié)構(gòu)觀察（HE，×20）Fig.1 Observation of hippocampal dentate gyrusstructure of mice in each group（HE，×20）

圖2 各組小鼠血清TNF-α含量（x±s）Fig.2 Content of TNF-α in serum of miceineach group（x±s）

圖3 各組小鼠血清IL-1β含量（x±s）Fig.3 Content of IL-1β in serum of micein each group（x±s）

圖4 各組小鼠腦組織ChAT活性（x±s）Fig.4 Activity of ChAT in brain of mice in each group（x±s）

2.5 桑辛素對D-半乳糖致老年性癡呆小鼠腦組織p53表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測方法，檢測腦組織中p53蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠腦組織p53表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，PRT組和MRS給藥組小鼠腦組織p53表達(dá)量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與MRS-L組比較，MPS-H組和PRT組小鼠腦組織p53表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）。見圖6-7。

圖5 各組小鼠腦組織ACH含量（x±s）Fig.5 Content of ACH in brain of mice in each group（x±s）

圖6 各組小鼠腦組織p53表達(dá)Fig.6 Expression of p53 in brain of micein each group

圖7 各組小鼠腦組織p53表達(dá)（x±s）Fig.7 Expression of p53 in brain of mice in each group（x±s）

3 討論

AD是一種常發(fā)生于老年期，以記憶缺失進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。AD發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，迄今尚無完全闡明，而且藥物治療效果有限，不良反應(yīng)較多。故針對AD的防治已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究中的重要內(nèi)容之一。目前針對AD的臨床治療主要采用乙酰膽堿酯酶抑制劑石杉堿甲、大腦神經(jīng)細(xì)胞類保護(hù)劑吡拉西坦和抗氧化劑維生素E等藥物。吡拉西坦廣泛應(yīng)用于臨床AD防治，也多用于AD動物模型的實(shí)驗(yàn)研究[7]，故本實(shí)驗(yàn)選用吡拉西坦作為陽性藥物進(jìn)行研究。

Morris水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)是分別評價(jià)學(xué)習(xí)能力和記憶能力的經(jīng)典方法[6]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的潛伏期明顯延長，穿越平臺的次數(shù)減少，多采用趨向式的探索策略，提示模型組小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力均受到損害，也表明了D-半乳糖致老年性癡呆小鼠造模成功，而桑辛素給藥組小鼠上述指標(biāo)較模型組明顯改善，呈劑量依賴性，提示桑辛素可明顯改善AD小鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力。而模型組小鼠海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞損傷嚴(yán)重，桑辛素給藥組小鼠海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯改善，間接提示AD模型的成功和桑辛素明顯改善腦海馬齒狀回的神經(jīng)損傷。炎癥是AD重要的發(fā)病機(jī)制之一，TNF-α和IL-1β是兩個(gè)重要促炎因子，參與AD的發(fā)生發(fā)展過程。AD開始階段，TNF-α可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)分泌大量IL-1β，引起一系列的炎癥級聯(lián)反應(yīng)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)桑辛素給藥組可明顯抑制AD的炎癥反應(yīng)，從而減輕AD的炎癥損傷。膽堿能神經(jīng)功能低下是AD另一重要的發(fā)病機(jī)制，乙酰輔酶A在ChAT的催化下結(jié)合膽堿生成ACH，作用于腦組織中的膽堿受體，引起機(jī)體一系列的生理功能變化[9-10]。通常AD患者腦內(nèi)ChAT活力下降，ACH合成不足。本研究發(fā)現(xiàn)桑辛素可明顯提高腦內(nèi)ChAT活力和ACH的含量，加強(qiáng)膽堿能神經(jīng)功能。p53是機(jī)體內(nèi)的一種抑癌基因，Aβ可直接激活p53，激活的p53被磷酸化生成p-p53，進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)桑辛素可明顯抑制腦內(nèi)p53的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，桑辛素對D-半乳糖致AD小鼠具有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減輕炎癥、抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和增加神經(jīng)突觸間的ACH含量和ChAT活性有關(guān)。