,*

(1.長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院,吉林長春 130117;2.延邊朝鮮族民族醫(yī)醫(yī)院,吉林延邊 133000)

血紅鉚釘菇(Chroogomphusrutilus(Schaeff.)O.K. Mill.)屬于擔子菌亞門牛肝菌目鉚釘菇科鉚釘菇屬,是東北地區(qū)珍貴的野生食用菌,俗稱松蘑、紅蘑、松樹傘等[1]。是一種與松樹共生的外生菌根性真菌[2],營養(yǎng)價值極高,深受人們喜愛。血紅鉚釘菇味平性甘,具有清熱解毒,健脾益胃等功效[3]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),血紅鉚釘菇含有多糖、蛋白質(zhì)、香豆素、酚類、甾醇、脂肪酸等多種成分[4]。高嬋娟[5]從血紅鉚釘菇中分離得到GRMPW、GRMPS兩種水溶性多糖,結(jié)構(gòu)表征分析表明GRMPW、GRMPS均由葡萄糖和木糖按不同比例組成。楊雪[6]對血紅鉚釘菇總黃酮提取、純化,并通用波譜進行分析,結(jié)果表明,優(yōu)化后總黃酮提取率為6.72%,其主要成分為黃芩苷。羅杰[7]采用多種色譜分離方法,從血紅鉚釘菇二氯甲烷層中分離出39個化合物,主要為甾醇、酚類、核苷等成分。李貞卓[8]利用GC-MS對石油醚層提取物進行分析,結(jié)果鑒定出8種物質(zhì),以亞油酸、十八碳烯酸等不飽和脂肪酸為主。但目前關(guān)于血紅鉚釘菇的成分測定分析研究較少,無法對血紅鉚釘菇子實體的質(zhì)量進行控制。

麥角甾醇作為食用真菌中特征甾醇,具有抗炎、抗腫瘤、抑制膽固醇[9]的吸收等多種藥理活性,可作為食用真菌生物量的重要指標[10]。黃酮、酚酸類化合物廣泛存在于食用菌中,是其發(fā)揮抗氧、抗腫瘤、抗炎等作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[11-12]。為全面反映血紅鉚釘菇子實體的質(zhì)量,評價不同產(chǎn)地之間的差異性,本研究采用多指標、多手段進行綜合性評價,建立新的HPLC方法測定血紅鉚釘菇中麥角甾醇的含量,同時在采用紫外分光光度法測定總黃酮、總酚酸的含量。目前指紋圖譜技術(shù)在食用菌的鑒別、質(zhì)量控制等方面應(yīng)用越來越廣泛,能夠全面體現(xiàn)食用菌有效成分的整體性、穩(wěn)定性,以及不同產(chǎn)地間的共有性圖譜片段[13-14]。因此,繼續(xù)建立了10批不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇的指紋圖譜,通過聚類分析,擬從整體上評價血紅鉚釘菇子實體的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥材 于2018年9月中旬采集于吉林省延邊朝鮮族自治州,經(jīng)長春中醫(yī)藥大學張輝教授鑒定為血紅鉚釘菇(Chroogomphusrutilus(Schaeff.)O.K.Mill.)的干燥子實體,藥材來源見表1;乙腈 色譜純,美國Fisher公司;三氟乙酸(Trifluoroacetic Acid,TFA) 色譜純,北京百靈威公司;十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS) Sigma-Aldrich公司;槲皮素、沒食子酸 中國食品藥品檢定研究院(純度均≥98%),批號100081-200907、110831-20080;麥角甾醇 實驗室分離自制(純度>95%);其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

表1 血紅鉚釘菇藥材來源Table 1 Origins of Chroogomphus rutilus

Agilent1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;SPECORD200PLUS紫外可見分光光度計 德國ANALYTIKJENA公司;WP-UP-III-40超純水機 四川Water Purifier公司;BP211D電子天平 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液的制備 取粉碎后血紅鉚釘菇子實體粗粉2.0 g,置100 mL錐形瓶中,加50 mL甲醇,稱重,超聲(功率100 W)1 h,放冷,再次稱重,補足重量,過濾,濾液水浴蒸干,加甲醇溶解,定容到25 mL的量瓶中,即得。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取麥角甾醇、槲皮素、沒食子酸對照品,加入甲醇溶解,分別配制成0.104、0.540、0.204 mg/mL的對照品溶液。

1.2.3 色譜條件 Aglient Eclipse plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);檢測波長282 nm;柱溫25;進樣量10 μL;流動相乙腈(A)-0.1% TFA水,流動相條件0～7 min:30%～70% A;7～20 min:70%～85% A;20～25 min:85%～92% A;25～50 min:92%～100% A;50～60 min:100% A;60～65 min:100%～30% A;65～75 min:30% A;流速1.0 mL/min。

1.2.4 麥角甾醇含量測定

1.2.4.1 標準曲線的繪制 分別精密量取麥角甾醇對照品溶液4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL按1.2.3項下條件進行測定[15]。將麥角甾醇的質(zhì)量作為橫坐標(X),將峰面積值作為縱坐標(Y),繪制標準曲線。

1.2.4.2 樣品含量測定 10批不同產(chǎn)地的血紅鉚釘菇根據(jù)1.2.1項下方法制備樣品溶液,運用1.2.3項下色譜條件分析,計算麥角甾醇的含量。

1.2.5 總黃酮含量測定

1.2.5.1 標準曲線的繪制 分別取槲皮素對照品溶液0、50、100、200、300、400 μL至10 mL比色管中,加70%乙醇至5 mL,加入5% NaNO20.3 mL,搖勻,靜置6 min,再加10% Al(NO3)30.3 mL,搖勻,靜置6 min,再加4% NaOH 2 mL,用70%乙醇定容到10 mL,搖勻,靜置6 min,于510 nm波長下測吸光度[16-17]。以槲皮素的濃度為橫坐標(X),吸光度為縱坐標(Y),繪制標準曲線。

1.2.5.2 樣品含量測定 移取樣品溶液0.2～10 mL比色管中,按1.2.5.1項下方法測定,計算總黃酮的含量。

1.2.6 總酚酸含量測定

表2 麥角甾醇加樣回收率實驗結(jié)果Table 2 Results of the recovery test for ergosterol

1.2.6.1 標準曲線的繪制 采用K3[Fe(CN)6]-FeCl3顯色體系進行顯色分析[18],分別取沒食子酸對照品溶液0、100、200、250、300、400 μL至10 mL比色管中,加無水乙醇至5 mL,靜置5 min,加0.3% SDS 2 mL,再加0.6% FeCl3-0.9% K3[Fe(CN)6](1∶1)1 mL,避光靜置6 min,用0.1 mmol/L定容到10 mL,搖勻,避光放置30 min,于733 nm下測吸光度。以沒食子酸的濃度作為橫坐標(X),吸光度作為縱坐標(Y),繪制標準曲線。

1.2.6.2 樣品含量測定 移取樣品溶液0.2～10 mL比色管中,按1.2.6.1項下方法測定,計算總黃酮的含量。

1.2.7 不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇HPLC指紋圖譜的建立 取10批不同產(chǎn)地的血紅鉚釘菇樣品溶液,運用1.2.3項下色譜條件測定。將10批血紅鉚釘菇的HPLC數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版A”進行分析[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件,對不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇的含量差異性進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 麥角甾醇含量測定方法學驗證

2.1.1.1 標準曲線 按1.2.4.1項下方法進行標準曲線繪制,得回歸方程為Y=936859X+9.2889,R2=0.9999,結(jié)果表明進樣量分別在0.416～2.08 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.1.2 方法學驗證 取麥角甾醇對照品溶液10 μL,連續(xù)進樣6次,結(jié)果顯示麥角甾醇含量的RSD為0.85%,說明儀器精密度高;取1號血紅鉚釘菇樣品,按1.2.1項下方法制備6份溶液,分別進樣分析,結(jié)果顯示,麥角甾醇含量的RSD為1.44%,說明該方法重復(fù)性好;取1號血紅鉚釘菇溶液,分別在制備0、2、4、8、16、24 h后進樣分析,結(jié)果顯示,麥角甾醇含量的RSD為2.92%,表明樣品在制備24 h內(nèi)穩(wěn)定性好;取1號血紅鉚釘菇樣品加入一定量的麥角甾醇對照品溶液,根據(jù)1.2.1項下方法制備樣品,并根據(jù)1.2.3項下方法進行分析,結(jié)果見表2,加樣回收率在98.22%～103.97%,RSD為2.18%,表明試驗方法有較好的回收率,回收結(jié)果準確可靠。

2.1.2 總黃酮含量測定方法學驗證

2.1.2.1 標準曲線 按1.2.5.1項下方法進行標準曲線繪制,得線性回歸方程Y=7.0943X+0.3623,R2=0.9996,結(jié)果表明槲皮素溶液濃度為2.7～21.6 μg/mL時,其與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.2.2 方法學驗證 取1號血紅鉚釘菇樣品,按1.2.1項下方法制備溶液,連續(xù)測定6次[20-22],結(jié)果顯示,總黃酮含量的RSD為0.89%,說明儀器精密度高。取1號血紅鉚釘菇樣品6份,根據(jù)1.2.1項下方法制備溶液,測定A值[20-22],結(jié)果顯示,總黃酮的含量的RSD為1.85%,說明方法重復(fù)性良好。取1號血紅鉚釘菇溶液,分別在制備0、20、40、60、80、120 min后測定[20-22],結(jié)果顯示,總黃酮含量的RSD為2.57%,表明制備的樣品在120 min內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.1.3 總酚酸含量測定方法學驗證

2.1.3.1 標準曲線 按1.2.6.1項下方法進行標準曲線繪制,得線性回歸方程Y=46.075X+0.4176,R2=0.9990,結(jié)果表明沒食子酸溶液濃度為2.04～8.16 μg/mL時,其與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.3.2 方法學驗證 取1號血紅鉚釘菇樣品,按1.2.1項下方法制備溶液,連續(xù)測定6次[20-22],結(jié)果顯示,總酚酸含量的RSD為0.40%,表明儀器精密度高。取1號血紅鉚釘菇樣品6份,按1.2.1項下方法制備溶液,測定A值[20-22],結(jié)果顯示,總酚酸的含量的RSD為0.52%,說明方法重復(fù)性良好。取1號血紅鉚釘菇溶液,分別在制備0、20、40、60、80、120 min后測定[20-22],結(jié)果顯示,總酚酸的含量的RSD為2.06%,說明制備的樣品120 min內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.2 不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇主要成分含量

結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇的主要成分含量存在差異。10批血紅鉚釘菇樣品中,麥角甾醇含量為(1.82±0.02)～(2.14±0.03) mg/g,總黃酮含量為(4.62±0.14)～(10.35±0.13) mg/g,總酚酸含量為(6.73±0.06)～(9.27±0.06) mg/g。麥角甾醇含量最高的是2號(龍井東山),為(2.14±0.03) mg/g,顯著高于其他產(chǎn)地的樣品(P<0.05);總黃酮含量最高的要1號(延吉延?xùn)|村),為(10.35±0.13) mg/g,顯著高于其他產(chǎn)地的樣品(P<0.05);總酚酸含量最高的是4號(汪清長興村),為(9.27±0.067) mg/g,顯著高于其他產(chǎn)地的樣品(P<0.05)。

表3 不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇主要成分含量(mg/g dw)Table 3 Content of main chemical compositions of Chroogomphus rutilus produced from different areas(mg/g dw)

注:表中數(shù)值以平均值±標準偏差表示(n=3),同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立及分析

2.3.1 指紋圖譜的建立 通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版A”的分析,得到10批不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇的HPLC指紋圖譜及對照圖譜(圖1)。

表4 不同血紅鉚釘菇樣品的相似度評價Table 4 Similarity evaluation of different kinds of Chroogomphus rutilus samples

圖1 不同血紅鉚釘菇樣品的 HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of different kinds of Chroogomphus rutilus samples

2.3.2 相似度評價 以血紅鉚釘菇的HPLC對照指紋圖譜為對照,進行整體相似度評價[23]。結(jié)果顯示,10批血紅鉚釘菇的相似度均在0.994以上(表4),表明各不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇的化學成分一致性較好,均含有10個成分,但各成分含量存在差異。

2.3.3 共有峰的指認及相關(guān)分析 通過分析生成的共有模式圖,確定了血紅鉚釘菇HPLC指紋圖譜中10個色譜峰為共有峰[22],其中6號色譜峰的保留時間適中、分離效果較好,因此選6號峰為參比峰,同時經(jīng)對照品比對,確定10號峰為麥角甾醇。共有模式圖中10個共有峰的相對保留時間(相對峰面積)分別為0.314(0.087),0.571(0.137),0.686(3.570),0.734(0.100),0.788(0.260),1.000(1.000),1.182(0.280),1.526(0.301),1.638(0.192),1.931(0.524)。

圖2 麥角甾醇對照品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of ergosterol substance control

圖3 血紅鉚釘菇HPLC圖譜的共有模式圖Fig.3 The common pattern of HPLC fingerprint of Chroogomphus rutilus

2.3.4 指紋圖譜方法學驗證 取1號血紅鉚釘菇溶液,連續(xù)6次進樣[24],結(jié)果見表5,10個共有峰的相對保留時間的RSD均<1%、相對峰面積RSD均<2%,說明該儀器的精密度較好。取1號血紅鉚釘菇樣品,按1.2.1項下方法制備6份溶液,分別進樣[24],結(jié)果見表6,10個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3%,說明方法重復(fù)性良好;取1號血紅鉚釘菇溶液,分別在制備0、2、4、8、16、24 h后進樣[24],結(jié)果見表7,10個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3%,說明樣品在制備24 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

表5 指紋圖譜精密度實驗結(jié)果Table 5 Experimental results of fingerprint precision

注:表中數(shù)據(jù)為相對保留時間/相對峰面積;表6、表7同。

表6 指紋圖譜重復(fù)性實驗結(jié)果Table 6 Experimental results of fingerprint repeatability

表7 指紋圖譜穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 7 Experimental results of fingerprint stability

2.4 聚類分析

根據(jù)10批不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇的10個共有峰的峰面積,經(jīng)SPSS 20.0處理,得到聚類分析圖(圖4)。根據(jù)聚類分析結(jié)果,將10批樣品分為2類,其中S3和龍頭道、S7和龍青龍以及S10琿春松洞為歸為一類;S1延吉延?xùn)|村、S2龍井東山、S4汪清長興村、S5圖門四方粒子、S6龍井黃記溝、S8和龍小和龍、S9延吉九龍歸為一類。該結(jié)果與相似度評價結(jié)果較為一致。血紅鉚釘菇主要成分含量基本按照高經(jīng)度向低經(jīng)度聚集、高緯度向低緯度聚集的規(guī)律,只有琿春松洞產(chǎn)地的血紅鉚釘菇表現(xiàn)不同,是地名記錄有誤、GPS定位有誤、還是客觀屬性有待進一步分析。

表8 不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇指紋圖譜的共有峰面積Table 8 Common peak areas of fingerprints of different kinds of Chroogomphus rutilus samples

圖4 不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇樣品的綜合聚類分析Fig.4 Comprehensive clustering analysis of different kinds of Chroogomphus rutilus samples

3 結(jié)論

本文建立新的HPLC方法完成了血紅鉚釘菇中麥角甾醇的含量測定,經(jīng)驗證,該方法穩(wěn)定、可控,同時各主要峰有良好的分離度。為了更加全面、科學、合理評價血紅鉚釘菇的質(zhì)量,因此采用多指標評價,在測定麥角甾醇含量的基礎(chǔ)上增加了總黃酮、總酚酸的含量測定。分析結(jié)果顯示,10批不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇樣品中麥角甾醇、總黃酮、總酚酸的含量存在顯著差異(P<0.05),麥角甾醇、總黃酮和總酚酸含量最高的樣品分別來自于龍井東山、汪清長興村和延吉延?xùn)|村,而延吉九龍樣品中麥角甾醇的含量最低,琿春松洞的樣品總黃酮含量最低,來自和龍頭道的樣品總酚酸含量最低。

多指標評價和指紋圖譜與相結(jié)合的方法可以更加全面評價血紅鉚釘菇子實體的質(zhì)量,提高了血紅鉚釘菇的穩(wěn)定性和一致性。本研究所建立的不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇子實體的HPLC指紋圖譜,可反映樣品的特異性和整體性信息。在比較相對保留時間后,確定10個色譜峰是共有峰,指認了10號峰為麥角甾醇。10批血紅鉚釘菇的相似度評價結(jié)果表明,各產(chǎn)地的相似度均在0.994以上,表明各不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇樣品的化學成分一致性較好,均含有10個成分,但各成分含量存在差異。聚類分析結(jié)果表明,不同產(chǎn)地血紅鉚釘菇分為兩大類,其中和龍頭道、龍青龍以及琿春松洞為一類,其他產(chǎn)地為一類,血紅鉚釘菇質(zhì)量基本按照高經(jīng)度向低經(jīng)度聚集、高緯度向低緯度聚集的基本規(guī)律。但同時因樣本量太少、分布范圍不夠廣泛、采摘之后的干燥,儲藏信息不完善等因素,導(dǎo)致產(chǎn)地劃分可能不是很明確。通過本研究可以確定采用高效液相色譜法建立血紅鉚釘菇子實體指紋圖譜是可行,為血紅鉚釘菇子實體指紋圖譜的進一步研究奠定基礎(chǔ)。下一步將擴大樣本量,完善樣本信息,通過HPLC-MS等手段,定性分析其他共有峰,同時采用主成分分析研究各共有峰對血紅鉚釘菇指紋圖譜差異的貢獻值[25]。