(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

中國是酒類生產(chǎn)和消費大國,長期飲酒可導(dǎo)致全身多系統(tǒng)多器官損傷,除了最常見的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷,酒精的免疫毒性也越來越受到人們的關(guān)注。慢性酒精中毒對機體免疫系統(tǒng)有抑制作用,一方面,酒精可直接抑制脾臟和胸腺T淋巴細胞的生成量及其功能,降低免疫相關(guān)細胞因子的表達[1];另一方面,酒精可引起肝損傷,使得患者普遍出現(xiàn)體液免疫和細胞免疫異常,造成機體免疫力低下[2]。此外,長期過量飲酒還會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、能量及維生素攝入不足而產(chǎn)生營養(yǎng)不良,出現(xiàn)營養(yǎng)性免疫抑制[3]。因此研究開發(fā)拮抗酒精免疫毒性的天然、無毒、營養(yǎng)的保健食品是目前醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)注的熱點。

玉米肽是玉米蛋白的酶解產(chǎn)物,具有醒酒、保肝、抗疲勞、抗氧化等多種活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)玉米肽還具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。馬子淇等[4-5]以玉米黃粉為原料,制備并純化出免疫活性肽,發(fā)現(xiàn)其具有促進小鼠脾淋巴細胞增殖的能力,且有劑量依賴性。吳曉萌[6]發(fā)現(xiàn)玉米黃漿多肽能顯著增加正常小鼠免疫器官指數(shù)、足跖腫脹程度、血清抗體水平及碳廓清能力。此外,張智等[7]將玉米肽與益生菌進行復(fù)合,發(fā)現(xiàn)該復(fù)合益生菌-玉米肽具有增強細胞免疫功能作用,并且能促進免疫球蛋白A的產(chǎn)生。玉米肽作為天然的保健食品,可減少藥物治療的副作用,保證消費者健康,必然受到消費者的歡迎。本文以具有自主知識產(chǎn)權(quán)的玉米肽為研究對象,探討其對慢性酒精中毒小鼠免疫功能的影響,以期為進一步研究玉米源免疫活性肽的免疫增強作用及其機制提供新的理論依據(jù)。

表1 玉米肽對慢性酒精中毒小鼠體重、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 1 Effect of corn peptide on body weight,spleen and thymus index of chronic alcoholism mice

注:不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)間差異顯著,P<0.05;表2同。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級昆明小鼠(18±2) g 60只 遼寧長生生物技術(shù)有限公司[質(zhì)量合格證號 211002300019054,實驗動物生產(chǎn)許可證為 SCXK(遼)2015-0001];玉米肽粉 齊齊哈爾易翔食品有限公司[蛋白含量49.5%,肽分子量<1 kDa,其余為淀粉];小鼠干擾素γ酶聯(lián)免疫試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫試劑盒、小鼠白介素6酶聯(lián)免疫試劑盒 上海江萊生物科技有限公司;GSH、MDA和SOD試劑盒 南京建成生物生物科技有限公司;其它試劑均為常規(guī)試劑。

T-114分析天平 美國丹佛儀器;EnSpire全波長多功能酶標(biāo)儀 美國珀金埃爾默公司;CF15RXII型高速離心機 日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)與分組 昆明小鼠60只,雌雄各半,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,隨機分為5組,每組12只,分別為正常對照組、慢性酒精中毒模型組、玉米肽高、中、低劑量組。

加肽鼠糧的制作:按肽的蛋白含量(g)和基礎(chǔ)鼠糧重量(g)的比例1∶500、3∶500和5∶500制備加肽鼠糧,分別為低、中、高玉米肽劑量組。

模型建立:自由飲用含酒精水建立小鼠慢性酒精中毒模型,水中酒精體積分數(shù)由6%、9%、12%,各飼喂5 d后調(diào)整到20%,以20%的酒精濃度維持飼養(yǎng)5個月,正常對照組小鼠飲用不含酒精的水;正常對照組和酒精模型組飼喂正常鼠糧,玉米肽組飼喂加肽鼠糧,自由攝食。

1.2.2 脾臟指數(shù)/胸腺指數(shù)的測定 試驗結(jié)束后,禁食、不禁水12 h,稱重后處死小鼠,剝離脾臟和胸腺并稱重,計算脾臟/體重和胸腺/體重比值(mg/g)。

1.2.3 病理組織學(xué)觀察 試驗結(jié)束后,小鼠脾臟和胸腺組織制成HE染色切片并做病理學(xué)觀察。

1.2.4 血清中細胞因子的測定 試驗結(jié)束后,禁食、不禁水12 h,稱重后眼球取血,室溫靜置,析出血清后,于4 ℃、1000×g離心15 min,收集血清,按照各試劑盒說明書測定血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ含量。

1.2.5 血清及肝臟中GSH、MDA含量及SOD活性測定 試驗結(jié)束后,禁食、不禁水12 h,稱重后眼球取血,解剖取肝臟組織,使用生理鹽水制備質(zhì)量分數(shù)為10%組織研磨液,4 ℃、1000×g離心15 min,收集上清液,按照各試劑盒說明書測定GSH、MDA含量及SOD活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件,對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,差異顯著者再進行LSD檢驗。各組數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±SD表示,不同小寫字母角標(biāo)表示各組數(shù)值比較差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米肽對慢性酒精中毒小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響

由表1可知,與正常對照組相比,酒精模型組和玉米肽高中低三個劑量組的小鼠體重均顯著降低(P<0.05),表明長期慢性的酒精處理可引起小鼠體重減輕;酒精模型組小鼠脾臟系數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),表明酒精處理后,小鼠脾臟出現(xiàn)腫大,但是胸腺的臟器指數(shù)尚未出現(xiàn)顯著變化。玉米肽各劑量組對酒精引起的小鼠體重降低并未表現(xiàn)出顯著的改善作用,但玉米肽中劑量組顯著降低了小鼠脾臟系數(shù)(P<0.05),緩解了脾臟損傷,對酒后脾臟有一定的保護作用。

2.2 玉米肽對慢性酒精中毒小鼠脾臟和胸腺病理組織學(xué)的影響

脾臟是機體重要的外周免疫器官,擁有25%全身循環(huán)的T淋巴細胞,是免疫細胞增殖和接受抗原刺激產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答的場所。動物實驗表明,長期過量飲酒對脾臟的生長發(fā)育具有顯著的抑制作用,可引起脾細胞脂質(zhì)過氧化,細胞膜通透性增強,膜表面受體受損,進而影響機體的各項免疫功能[8]。

圖1 小鼠脾臟病理學(xué)觀察結(jié)果(100×)Fig.1 Pathological observation results of spleen in mice(100×)

小鼠脾臟病理切片見圖1。結(jié)果表明,與正常對照組相比,酒精模型組脾臟白髓比例增大,白髓內(nèi)細胞數(shù)量增多;而與酒精模型組比較,玉米肽低劑量組脾臟紅髓比例增多,可見較多含鐵血黃素,白髓內(nèi)細胞數(shù)量略減少,并可見細胞核溶解;玉米肽中劑量組中紅髓比例明顯增多,白髓內(nèi)細胞數(shù)量減少,并可見細胞核溶解;玉米肽高劑量組脾臟中白髓比例較中劑量組增多,但仍可見細胞溶解?？梢?玉米肽各劑量組脾臟白髓面積及細胞數(shù)量均得到不同程度的恢復(fù)。

圖2 小鼠胸腺病理學(xué)觀察結(jié)果(100×)Fig.2 Pathological observation results of thymus in mice(100×)

胸腺對機體T細胞分化、成熟起到重要作用,酒精可降低胸腺中淋巴細胞生成量及釋放率[8]。由圖2可見,酒精模型組小鼠胸腺已觀察不到胸腺小葉,且皮質(zhì)、髓質(zhì)不明顯;與正常對照組相比,玉米肽低劑量組的胸腺小葉及髓質(zhì)也不明顯。中劑量組可見血管充血,胸腺小葉內(nèi)細胞之間距離變大。高劑量組仍可見血管充血,但胸腺小葉內(nèi)細胞增多。玉米肽各劑量組胸腺病變均有不同程度的恢復(fù),但恢復(fù)較輕,僅比模型組略佳。

2.3 玉米肽對慢性酒精中毒小鼠血清細胞因子的影響

由表2可知,與正常對照組相比,慢性酒精中毒導(dǎo)致小鼠血清中細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6含量顯著降低(P<0.05),這與報道相一致[9-10]。與酒精模型組相比,玉米肽中、高劑量組小鼠血清中TNF-α含量顯著提高(P<0.05);玉米肽低、中、高三個劑量組小鼠血清中IFN-γ含量都有顯著提高(P<0.05);并且高劑量玉米肽還顯著提高了小鼠血清中IL-6的含量(P<0.05)。這些結(jié)果表明,玉米肽可以明顯改善酒精模型組小鼠血清中細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6水平。

表2 玉米肽對慢性酒精中毒小鼠血清細胞因子的影響Table 2 Effect of corn peptide on serum cytokine of chronic alcoholism mice

2.4 血清及肝臟組織中GSH、MDA含量及SOD活性

酒精代謝產(chǎn)生大量ROS,可消耗機體內(nèi)的抗氧化物質(zhì),GSH是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)之一。由圖3可知,酒精顯著降低了小鼠肝臟中抗氧化劑GSH的含量(P<0.05),但是對血清中GSH的含量沒有顯著影響(P>0.05)。與酒精模型組相比,低、中、高劑量組玉米肽皆可顯著降低酒精對肝臟中GSH的消耗(P<0.05),并且具有劑量依賴性,隨著玉米肽含量的增加,肝臟中GSH含量也隨之升高,恢復(fù)到正常水平。

圖3 小鼠血清及肝臟中GSH濃度Fig.3 The concentration of GSH in plasma and liver of mice 注:不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05;圖4～圖5同。

由圖4可見,與正常對照組相比,酒精可顯著增加小鼠肝臟及血清中MDA含量(P<0.05),MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,且具有細胞毒性。與酒精模型組相比,中、高玉米肽劑量組的小鼠血清和肝臟中MDA含量顯著降低(P<0.05);其中玉米肽高劑量組小鼠血清和肝臟中MDA水平與正常對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。這表明玉米肽可降低乙醇及其代謝產(chǎn)物引起的小鼠肝臟及血清中MDA水平的升高,保護免疫組織及細胞免受其毒性作用。

圖4 小鼠血清及肝臟中MDA水平Fig.4 The levels of MDA in plasma and liver of mice

由圖5可知,與正常對照組相比,酒精可顯著降低小鼠血清及肝臟中SOD活性(P<0.05)。與酒精模型組相比,中、高玉米肽劑量組小鼠血清及肝臟中SOD活性顯著升高(P<0.05)。其中玉米肽中劑量組小鼠血清和肝臟中SOD活性與正常對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。這表明玉米肽可恢復(fù)酒精中毒小鼠血清及肝臟中SOD活性。玉米肽本身就是一種抗氧化活性較強的活性寡肽,研究表明玉米肽可提高正常小鼠血清和肝臟中SOD活性,同時還可提高肝臟中GSH-PX活性[11]。

圖5 小鼠血清及肝臟中SOD活性Fig.5 The activity of SOD in plasma and live of mice

3 討論與結(jié)論

T細胞是機體細胞免疫的中心,可分泌多種細胞因子進而調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)。其中細胞因子TNF-α具有強化中性粒細胞的吞噬能力,還可以增加過氧化物陰離子產(chǎn)生,刺激細胞脫顆粒和分泌髓過氧化物酶、抗感染。IFN-γ可通過激活單核吞噬細胞殺滅微生物及腫瘤細胞,激活中性粒細胞和NK細胞,強化NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性,促進巨噬細胞的吞噬功能;IL-6是一種多效性細胞因子,在多種細胞功能調(diào)節(jié)方面具有重要的作用,包括細胞分化、免疫防御、增殖等;若IL-6水平降低,則會引起免疫系統(tǒng)中某個或多個節(jié)點發(fā)生障礙,從而導(dǎo)致機體免疫力下降[12]。長期酗酒可抑制T淋巴細胞的功能,使T淋巴細胞減少有絲分裂和對抗原的增殖反應(yīng)下降,細胞因子IFN-γ的合成和NK細胞活性也會降低,并且單核細胞所產(chǎn)生的細胞因子TNF-α、IL-1和IL-6也會下降[9];此外酒精引起營養(yǎng)不良,蛋白質(zhì)的缺乏也可降低機體免疫力,因為免疫防御依賴于細胞復(fù)制和具有生物活性的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生,如抗體、細胞因子等[13]。玉米肽具有促進乙醇代謝的醒酒作用,可明顯降低原發(fā)性高血壓大鼠血液中乙醇及其氧化產(chǎn)物乙醛濃度的作用,同樣的結(jié)果在健康人中也得到了印證[14-15]。在本研究中,與酒精模型組相比,高劑量玉米肽可以顯著改善慢性酒精中毒導(dǎo)致的小鼠血清中細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6含量的降低(P<0.05);一方面可能是因為玉米肽能夠加快酒精代謝速度,從而降低酒精對機體的直接損害作用,另一方面可能是因為玉米肽可通過為機體補充大量的氨基酸減輕機體蛋白質(zhì)缺乏狀態(tài),提高細胞因子的表達和活性,改善T淋巴細胞的功能,從而提高機體的免疫力。

酒精進入機體后,在乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶作用下,轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?并通過CYP2E1產(chǎn)生了多種活性氧,如乙氧基自由基、超氧自由基、過氧化氫、羥自由基等,導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激水平升高,損傷包括免疫細胞在內(nèi)的各組織細胞;同時還可損害機體內(nèi)保護性抗氧化劑,如降低機體中谷胱甘肽含量[16];乙醛還可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成加合物,如丙二醛和丙二醛乙醛加合物[1],進而導(dǎo)致機體免疫機能的下降。玉米肽的體內(nèi)外抗氧化活性已通過試驗證實。馬瑞等[17]發(fā)現(xiàn)玉米蛋白水解物可以通過直接降低細胞內(nèi)ROS含量來保護細胞;Liu等[11]證明玉米蛋白水解物可提高小鼠血清中SOD活性,這些研究表明玉米蛋白水解物在細胞及動物體內(nèi)具有明顯的抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn),玉米肽可降低酒精對肝臟中GSH的消耗,并具有劑量依賴性;同時中、高劑量組玉米肽還可恢復(fù)酒精中毒小鼠血清及肝臟中SOD活性。所以玉米肽可能是通過減輕酒精及其代謝物引起的氧化應(yīng)激,減少活性氧對機體細胞的損傷,改善慢性酒精中毒小鼠的脾臟和胸腺的損傷狀況;此外玉米肽可降低乙醇及其代謝產(chǎn)物引起的小鼠肝臟及血清中MDA水平的升高,保護免疫組織及細胞免受MDA的毒性作用,從而輔助增強機體的免疫功能。

綜上所述,長期過量酒精攝入會導(dǎo)致小鼠免疫器官損傷,降低機體免疫功能;玉米肽可明顯提高小鼠血清因子水平,改善機體氧化應(yīng)激狀態(tài),緩解慢性酒精中毒小鼠的脾臟和胸腺的損傷狀況,在一定程度上可以提高機體的免疫功能,具有保健功能。