陳友霞,劉珍珍,楊文藝,孔 霄,林 琳,高春燕

(大理大學公共衛(wèi)生學院,云南大理 671000)

蠶豆(ViciafabaL.)又名羅漢豆、胡豆或佛豆,在豆科作物中占有舉足輕重的地位,長期以來一直是發(fā)展中國家(主要是亞洲和非洲)的主要糧食作物[1-3]。我國是世界蠶豆種植面積最大的國家,種植地區(qū)主要分布于青海、甘肅和云南等省份,常年播種面積達到2500 km2,總產量達35萬噸[4]。蠶豆含有豐富的營養(yǎng)成分,含有22.4%～36.0%的蛋白質、57.8%～61.0%的碳水化合物、12.0%的膳食纖維和1.2%～4.0%的脂質[5]。此外,蠶豆是維生素、礦物質和生物活性化合物的良好來源,如酚類化合物,包括生育酚以及三萜酸[6-8]。目前大量的研究關注于成熟或干燥蠶豆的組成和功能活性,對未成熟蠶豆營養(yǎng)成分的研究較少。然而在一些地區(qū),例如智利[5]和中國[9]對新鮮和未成熟蠶豆的食用需求很大。近年來云南省鮮食蠶豆的生產規(guī)模發(fā)展迅速,年播種面積和總產量均居全國之首,是全國最大的鮮食蠶豆主產區(qū)[10]。

表1 火焰原子吸收分光光度計工作條件參數Table 1 Working conditions of flame atomic absorption spectrophotometer

礦物質和氨基酸是人體維持正常生理功能所必需的營養(yǎng)物質,且礦物質和必需氨基酸攝入過量或不足均會影響人體健康[11-14]。食物中氨基酸的種類、含量及各組分所占的比例是評價其蛋白質優(yōu)良程度的決定性指標[15-17]。已有研究證實,成熟蠶豆種子中礦物質和氨基酸含量極為豐富[18-21],然而關于未成熟蠶豆中的礦物質含量、氨基酸組成以及微觀結構的動態(tài)變化還未見報道。本研究以大理州農業(yè)科學院培育出的高產、抗銹新品種鳳豆15號和鳳豆18號為原料,對其三個不同食用階段種皮和胚中的礦物質含量、整粒蛋白的氨基酸組成和胚的微觀結構變化進行研究,以期為蠶豆新品種的培育、推廣及消費者科學地選購蠶豆提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兩個蠶豆品種 分別為鳳豆15號(FD15)和鳳豆18號(FD18),于2016年10月19日種植于大理農業(yè)科學院蠶豆研究基地(北緯:100°24′,東經:25°45′,海拔2090 m)。FD15的全生育期為166～170 DAS,FD18的全生育期為172～179 DAS,本實驗分三個食用階段S1(138 DAS)、S2(156 DAS)和S3(173 DAS)進行隨機采收,其中S3階段已達到成熟期(DAS:Days after seeding,播種后的天數);鈣、鎂、鉀、鐵、鋅、錳、銅、鉻標準溶液(1000 μg/mL) 國家標準物質研究中心;硝酸、鹽酸(優(yōu)級純) 西隴科學股份有限公司;氫氧化鈉(分析純) 天津市福晨化學試劑廠;鹽酸、檸檬酸鈉(分析純) 天津市風船化學試劑科技有限公司。

Scientz-ND型系列真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;AA-6200火焰原子吸收分光光度計 日本島津公司;RJM-28-10馬弗爐 湖南長沙市華光電爐廠;DK-98-II電爐 天津市泰斯特儀器有限公司;DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;RE-3000旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;L-8900自動氨基酸分析儀 日本日立公司;掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy,SEM) 荷蘭皇家飛利浦電子公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠶豆樣品的制備 將三個食用階段的未成熟蠶豆手工去除豆莢并冷凍干燥(-51 ℃,12 h),手工分為整粒種子、種皮和胚三部分,粉碎過60目篩,儲存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 礦物質含量的測定 參照Lu等[22]的方法,采用干灰化法消化樣品(稱取0.5 g蠶豆種皮和胚的凍干粉末,首先在電爐上碳化,然后置于馬弗爐中在(500±25) ℃下灰化4 h),然后溶解在10 mL 10%硝酸(V/V)中。最后,采用火焰原子吸收分光光度計測定K、Mg、Ca、Zn、Fe、Cu、Mn和Cr的含量,結果表示為mg/100 g干重?；鹧嬖游辗止夤舛扔嫻ぷ鲄狄姳?。

1.2.3 氨基酸組成分析 根據Gao等[23]的方法,取整粒干燥的蠶豆整粒種子粉末溶解于NaOH(pH10.0)溶液中,室溫下振蕩提取3 h,12000 r/min離心10 min,取上清液滴加鹽酸將其酸化至pH=4沉淀蛋白質,再以12000 r/min離心10 min回收沉淀的蛋白質,并冷凍干燥(-51 ℃,12 h)。隨后,精密稱取100 mg冷凍干燥所得的蛋白提取物在氮氣下于110 ℃用10 mL 6 mol/L HCl水解22 h,然后用旋轉蒸發(fā)器(50 ℃,200 r/min)濃縮水解產物,再用檸檬酸鈉緩沖液(0.02 mol/L,pH2.2)溶解并定容至5 mL。最后,將所得樣品通過0.22 μm聚四氟乙烯微孔濾膜(PTFE)過濾,并采用氨基酸分析儀測定除色氨酸外的17種氨基酸含量,即天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)。

1.2.4 電子顯微鏡掃描 將干燥的蠶豆胚顆粒均勻分布在粘有導電雙面膠的銅柱上,然后固定在載物臺上,在低真空模式,20.0 kV、50 Pa的條件下對其微觀結構進行掃描電鏡(1000×)觀察。

1.3 數據處理

表2 不同食用階段蠶豆種皮、胚中的礦物質含量(mg/100 g DW)Table 2 Mineral content in seed coat and embryo of broad bean in different edible stages(mg/100 g DW)

注:ND代表沒有檢測到;同列不同小寫字母表示相同蠶豆品種不同食用階段差異顯著(P<0.05);同列不同大寫字母表示相同食用階段不同蠶豆品種間差異顯著(P<0.05);表3同。

2 結果與分析

2.1 不同食用階段蠶豆的礦物質含量

兩個品種三個食用階段的未成熟蠶豆種皮和胚中礦物質含量的測定結果見表2。結果表明,種皮中含量最高的礦物質是K(490.23～873.01 mg/100 g DW),其次是Mg(45.43～58.21 mg/100 g DW)、Ca(16.11～81.09 mg/100 g DW)、Zn(3.83～7.59 mg/100 g DW)、Cu(0.76～2.91 mg/100 g DW)、Mn(0.73～1.24 mg/100 g DW)和Fe(0.00～1.58 mg/100 g DW);胚中含量最高的是K(525.86～760.84 mg/100 g DW),其次是Mg(34.71～43.88 mg/100 g DW)、Ca(2.39～26.12 mg/100 g DW)、Zn(4.26～5.45 mg/100 g DW)、Fe(1.87～3.78 mg/100 g DW)、Cu(0.84～1.46 mg/100 g DW)和Mn(0.47～0.87 mg/100 g DW);且Cr在所有蠶豆樣品中均未檢出。由此可見,兩個品種三個食用階段的未成熟蠶豆種皮和胚中的主要礦物質均為K、Mg、Ca、Zn,且大部分能檢測到少量的Fe、Cu和Mn。

各礦物質元素在種皮和胚中的分布呈現多樣性。例如,Mg的含量在兩個品種的S1～S3階段均表現為種皮高于胚,而Fe正好相反;K和Cu的含量在兩個品種的S1～S2階段均表現為種皮高于胚,而在S3階段的含量表現為種皮低于胚。Ca、Zn和Mn的含量在FD18中的S1～S3階段均表現為種皮高于胚;而在FD15中Ca含量在其S1階段表現為種皮低于胚,在S2～S3階段種皮含量高于胚;Zn和Mn在FD15中S1～S2階段為種皮含量高于胚,而在S3階段相反。

不同礦物質元素在整個食用過程中的變化不同。例如,隨著食用階段的延后,K含量在兩個品種的種皮和胚中均呈現明顯下降趨勢;Ca在兩個品種的種皮中含量均逐漸增加,而在胚中的含量均逐漸降低;與Ca相反,Cu在兩個品種的種皮中含量逐漸降低,而在胚中的含量逐漸升高;Mn在兩個品種的種皮中含量無顯著變化(P>0.05),而在胚中的含量均逐漸升高。隨著食用階段的延后,不同品種的礦物質含量也存在差異,Mg在FD15種皮中的含量隨食用階段的延后逐漸降低,在胚中的含量呈先降低后升高的顯著變化趨勢(P<0.05),然而在FD18種皮和胚中的含量均無顯著變化。

實驗結果表明,蠶豆種皮和胚中的礦物質含量均十分豐富,各礦物質的含量與未成熟蠶豆的品種、部位和食用階段有關,這與柏方敏、劉建明、申小云等[24-26]的研究結果一致,即植物體內的礦物質含量受土壤中各化學元素的組成、含量水平及植物富集能力、植物品種等因素的影響。因此,蠶豆種皮中也含有豐富的礦物質,在食用過程中不要輕易舍棄種皮;此外,隨食用階段的延后礦物質含量變化較大,消費者應根據食用需求合理地選購蠶豆。

2.2 不同食用階段蠶豆的氨基酸組成

不同食用階段蠶豆蛋白氨基酸組成見表3。由表3可知,除Cys未檢測到外,其余16種氨基酸均檢測到?？偘被?TAA)含量范圍為20.71～85.44 g/100 g蛋白質,總的必需氨基酸(EAA)含量范圍為2.65～27.86 g/100 g蛋白質,非必需氨基酸(NEAA)含量范圍為18.06～57.58 g/100 g蛋白質。含量最為豐富的氨基酸是Glu、Asp、Arg和Leu,必需氨基酸除了Leu外,Lys、Ile、Phe和Val含量也較為豐富,這與Vioque等[1]的發(fā)現一致。

表3 不同食用階段蠶豆蛋白的氨基酸組成(g/100 g蛋白質)Table 3 Amino acid composition of broad bean protein in different edible stages(g/100 g protein)

注:a代表必需氨基酸;TAA代表總氨基酸。

TAA含量在兩個品種的S1～S3階段均顯著增加(P<0.05),EAA和大部分單個氨基酸含量與TAA含量變化趨勢一致。TAA和部分EAA(Leu、Ile、Val和Met)含量在三個食用階段中均表現為FD18>FD15。此外,兩個品種三個食用階段的EAA/TAA范圍為12.80%～37.35%,且兩個品種的EAA占比均為S2階段最高。氨基酸評分結果顯示,Met在兩個品種的各食用階段中氨基酸評分(AAS)均最低(8.9～18.6),且Cys在所有蠶豆樣品中均未檢出,這與先前的相關報道[27-28]一致,即大多數豆科種子缺乏含硫氨基酸。不同品種及各食用階段蠶豆蛋白氨基酸含量的差異及變化可歸因于氨基酸通透酶家族(AAP)、植物根際微生物、土壤質地和外界環(huán)境等因素的影響所致[29-30]。

氨基酸與礦物質之間的相關性分析結果顯示,FD15中Mg和Ile、Leu、Tyr、Lys具有顯著的負相關性(r=-0.999,P<0.05;r=-0.998,P<0.05;r=-0.999,P<0.05;r=-1.000,P<0.05),Fe與Glu也具有顯著的負相關性(r=-0.999,P<0.05)。FD18中Zn和Gly、Val之間具有顯著的正相關性(r=0.999,P<0.05;r=0.999,P<0.05),K和Pro具有顯著的負相關性(r=-1.000,P<0.05),其他礦物質與氨基酸之間均無相關性。這說明蠶豆在成熟過程中對礦物質的吸收、富集與氨基酸的合成之間沒有明顯的相互作用。

2.3 不同食用階段蠶豆的顯微結構

為了研究不同食用階蠶豆胚的微觀結構變化,采用掃描電子顯微鏡對其微觀結構進行了觀察,結果見圖1。圖1中觀察到的從卵形到球形不同形狀的顆粒是淀粉顆粒。附著在淀粉顆粒上的非均勻不規(guī)則的顆粒,它們代表蛋白質體或蛋白質基質、礦物質和纖維成分的碎片,這與Ma等[31-32]在不同豆科植物中所報道的一致。眾所周知,豆科植物種子在成熟過程中淀粉含量不斷增加[33]。從圖1中可以看出,蠶豆淀粉顆粒的大小隨食用階段的延后逐漸增加,這表明蠶豆胚中淀粉含量的增加可能是由于淀粉顆粒大小的增加。此外,淀粉顆粒的形狀和密度在不同品種之間是不同的,FD15中多角形占多數,而FD18中橢圓形或圓形占多數,且鳳豆18號中淀粉顆粒的密度大于鳳豆15號。這可能與遺傳因素、胚乳的充實程度、蛋白質含量及外界環(huán)境有關[34-35]。

圖1 不同食用階段蠶豆的掃描電子顯微照片(1000×)Fig.1 Scanning electron micrograph of broad bean in different edible stages(1000×)注:A1～A3表示鳳豆15號的S1～S3階段;B1～B3表示鳳豆18號的S1～S3階段。

3 結論

兩個未成熟蠶豆品種中含量最高的礦物質均為K、Mg、Ca、Zn,并均能檢測到少量的Fe、Cu和Mn,均未檢測到Cr,且大部分礦物質在種皮中的含量高于胚中;大體而言,礦物質含量在兩個未成熟蠶豆品種的種皮和胚中均隨食用階段的延后逐漸降低;蠶豆蛋白中氨基酸種類及含量豐富,其中總EAA含量范圍為2.65～27.86 g/100 g蛋白質,占TAA含量的12.80%～37.35%;大部分單個氨基酸和TAA含量隨著食用階段的延后不斷增加,且FD18中TAA含量和大部分EAA(Leu、Ile、Val和Met)的含量高于FD15,Met和Cys為限制性氨基酸;由相關性分析結果表明,未成熟蠶豆中氨基酸與礦物質之間沒有明顯的相互作用;微觀結構觀察結果顯示了蠶豆淀粉粒在不同食用階段過程中的變化,蠶豆淀粉顆粒的大小隨食用階段的延后逐漸增加,這表明蠶豆胚中淀粉含量的增加可能是由于淀粉顆粒大小的增加。此外,淀粉顆粒的形狀和密度在不同品種之間是不同的,FD15中多角形占多數,而FD18中橢圓形或圓形占多數,且鳳豆18號中淀粉顆粒的密度大于鳳豆15號。