陳秀明,3,劉 青,*,梁浩新,張嘉俊,文慧依,謝錦鋒,陳少敏

(1.廣東檢驗檢疫技術(shù)中心,廣東廣州 510623;2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點實驗室,廣東廣州 510623;3.北京師范大學(xué)-香港浸會大學(xué)聯(lián)合國際學(xué)院, 珠海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食品安全重點實驗室,廣東珠海 519087)

嬰幼兒配方奶粉是根據(jù)不同生長時期嬰幼兒的營養(yǎng)需要進(jìn)行設(shè)計的,以脫脂奶粉、乳清粉、乳糖等為主要原料,加入適量的維生素和礦物質(zhì)以及其他營養(yǎng)物質(zhì),經(jīng)加工后制成的粉狀食品。近10年來嬰幼兒配方奶粉的市場需求也在不斷增大,2007年至2010年間,嬰幼兒配方奶粉的世界產(chǎn)量平均每年以8.2%的速度增長,2010～2014年平均同比增長達(dá)到11%,2018年進(jìn)口嬰幼兒配方奶粉進(jìn)口量為32萬噸,同比增加9.6%。

巨大的市場需求為不法商人帶來了牟取暴利的可乘之機(jī),市場上摻假,以次充好的事件屢見不鮮。而不法分子向乳制品中添加三聚氰胺是為了提高氮含量,那么他們?yōu)榱艘?guī)避監(jiān)管部門的監(jiān)查,是否添加其他類似的富含氮的非法添加物,如雙氰胺、環(huán)丙氨嗪等等,這也是我們值得考慮和預(yù)防的問題。對于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使的摻假行為來說,在ppm量級水平摻假基本上是無利可圖的,因此,實際的摻假樣品中摻假物質(zhì)的含量應(yīng)該更高,且應(yīng)對經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使的摻假行為時,不需要進(jìn)行分離,而是檢測樣品整體成分的“指紋圖譜”,這種技術(shù)具有非常重要的作用。

近紅外光譜技術(shù)是一種便捷、無損、成本低,近幾年來廣泛應(yīng)用于石油、化學(xué)、制藥、農(nóng)業(yè)、食品等行業(yè)的高效檢測工具,在摻假鑒定方面也得到廣泛運用和推廣[1-4]。本文運用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法Adulterant Screen算法,建立嬰幼兒配方奶粉中常見非法添加物的快速鑒別方法,此方法建立的模型能實現(xiàn)快速鑒別多個非法添加物,如:雙氰胺、雙縮脲、尿素、三聚氰胺、硫脲、環(huán)丙氨嗪等6種含氮非法添加物,為嬰幼兒配方奶粉的檢測和監(jiān)管提供強有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嬰幼兒配方奶粉 從廣州式各大超級市場購買,收集16個品牌嬰幼兒配方奶粉共100個試樣,其中嬰兒配方奶粉35個、較大嬰兒配方奶粉36,幼兒配方奶粉29個;雙氰胺、雙縮脲、尿素、三聚氰胺、硫脲、環(huán)丙氨嗪 分析純AR,含量≥99%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DairyGuard近紅外光譜奶粉分析儀 PE(Perkin Elmer)公司,光源為NIR,分光器為CaF2,檢測器為NIR TGS,積分球為InGaAs,自動切換。光譜范圍10000～4000 cm-1,分辨率16 cm-1,波數(shù)準(zhǔn)確率±0.03 cm-1。

1.2 實驗方法

1.2.1 摻假物的選擇 在乳制品中添加三聚氰胺旨在提高氮含量,替代乳制品中的蛋白質(zhì),添加其他類似的含氮非法添加物也可以達(dá)到同樣的效果,故此,本文選擇可能出現(xiàn)的同類別含氮的非法添加物6種:雙氰胺、雙縮脲、尿素、三聚氰胺、硫脲、環(huán)丙氨嗪。

1.2.2 樣品集的劃分 收集的100個嬰幼兒配方奶粉樣品中,其中33個用作建立校正模型的集樣品,33個作為驗證集樣品,16個作為模擬摻假及摻雜樣品,6個作為空白待測樣品,12用作未知樣品。

1.2.3 模擬摻假樣品的制備 將16個嬰幼兒配方奶粉作為模擬摻假樣品,其中6個用在單組分摻假樣品,摻假添加4個水平濃度(0.04%～1.0%),6個用在二組分摻假樣品,采用6個摻假物隨機(jī)組合添加共6個組合,選擇添加濃度為單組分實驗的檢出限2倍、5倍、10倍3個水平濃度;4個用作三組分模擬摻假樣品,采用摻假物隨機(jī)組合共4個組合:三聚氰胺+雙氰胺+雙縮脲、雙縮脲+環(huán)丙氨嗪+雙氰胺、尿素+三聚氰胺+硫脲、尿素+硫脲+環(huán)丙氨嗪,選擇添加濃度為單組分實驗結(jié)果的檢出限2倍、5倍。

模擬摻假樣品的制備:首先將6種經(jīng)研磨至均勻粉末狀的含氮非法添加物稱取至干凈玻璃瓶中,再補充嬰幼兒配方奶粉至50 g,密封充分混勻,作為模擬摻假樣品,每個模擬摻假添加濃度制備6個平行樣。

1.2.4 光譜采集

1.2.4.1 樣品及摻假物的光譜采集 環(huán)境溫度20 ℃,相對濕度 45%,掃描范圍10000～4000 cm-1,掃描次數(shù) 32,每次扣除空氣本底,實時扣除空氣中的水和二氧化碳的強吸。摻假物先用研缽磨制成均勻的粉末,再進(jìn)行光譜采集。為了減小樣品及摻假物顆粒不均勻產(chǎn)生的誤差,測量2次平行,取2次采樣的平均值,裝樣時,在裝好樣品后用實心圓形鐵塊輕輕壓實,使得粉末分布均勻[5]。

1.2.4.2 光譜預(yù)處理 為了消除樣品光譜信號的高頻噪聲、基線漂移、雜散光、樣品背景等非目標(biāo)因素,通常采用光譜預(yù)測理的方法來減弱或消除非目標(biāo)因素對光譜的影響[6-9]。常用的光譜預(yù)處理方法有正規(guī)化、平滑(SG)、歸一化、一階導(dǎo)數(shù)(D1)、二階導(dǎo)數(shù)(D2)、多元散射校正(MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNV)等[10-15]。本文通過儀器內(nèi)置Spectrum FTIR軟件進(jìn)行光譜采集,選取的波段范圍為10000～4000 cm-1,采用對樣品光譜進(jìn)行一階求導(dǎo)、平滑(平滑窗口寬度為9)等預(yù)處理方法來濾除各類因素產(chǎn)生的高頻噪音。

1.2.5 Adulterant Screen法建立鑒別模型

1.2.5.1 Adulterant Screen算法 Adulterant Screen算法:是專門為復(fù)雜基質(zhì)中任意潛在摻假成分篩查而設(shè)計的新算法,該法既保留SIMCA等非靶向化學(xué)計量學(xué)方法的優(yōu)勢,而且通過建立的潛在摻假成分光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行計算獲得更高的鑒假靈敏度。當(dāng)獲得一個未知樣品光譜后,Adulterant Screen算法首先將其與標(biāo)準(zhǔn)樣品(材料光譜)的主成分(PCA)模型進(jìn)行比較,其次使用各種潛在摻假成分的光譜對該模型進(jìn)行擴(kuò)展,如果在模型中增加某種摻假成分光譜后,未知樣品光譜與其擬合程度得到顯著增加,說明該樣品很可能含有這種摻假成分。該算法輸出結(jié)果是摻假成分的估算濃度、檢測限及置信度指標(biāo),對濃度的估算是根據(jù)數(shù)據(jù)庫中摻假成分光譜與其在樣品光譜中的分量的相對強度,沒考慮有效光程的差異,因此為半定量估算結(jié)果,檢測限也采用同樣方式,置信度指標(biāo):可能、有可能、非?？赡?顯示的是該摻假成分實際存在的可能性大小,摻假物能準(zhǔn)確識別且可信度為“可能”時,可定義為最低檢出限[3,16-18]。

表1 空白樣品及單組分摻假樣品的鑒別結(jié)果(n=6)Table 1 Identification results of blank samples and single component adulterated samples(n=6)

1.2.4.2 非法添加物鑒別模型的建立 a材料光譜模型建立:將收集到的66個嬰幼兒配方奶粉樣品采集的光譜圖添加到“嬰幼兒配方奶粉分類模型”中,建立校正和驗證用光譜數(shù)據(jù)庫。b摻假物光譜模型建立:將收集到的6種含氮摻假物得到的光譜圖添加到“摻假物模型”中,用作摻假物光譜數(shù)據(jù)庫。將上述“嬰幼兒配方奶粉分類模型”和“摻假物模型”兩組光譜庫導(dǎo)入Spectrum FTIR軟件中,運用Adulterant Screen算法進(jìn)行計算,即完成非法添加物鑒別模型的建立。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SpectrumFTIR軟件進(jìn)行采集并處理計算[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單組分摻假樣品的鑒別結(jié)果與分析

樣品經(jīng)DairyGuard近紅外光譜奶粉分析儀采集光譜(所采集的樣品近紅外光譜如圖1,采集的非法添加物近紅外光譜如圖2所示),a基于Adulterant Screen算法建立的“嬰幼兒配方奶粉分類模型”,將樣品光譜與“嬰幼兒配方奶粉分類模型”的PCA光譜模型進(jìn)行比較,驗證是否為嬰幼兒配方奶粉;b基于“摻假物模型”,將樣品中可能潛在的摻假成分光譜對PCA光譜模型進(jìn)行擴(kuò)展,如果模型增加某種潛在成分光譜,待測樣品光譜與其擬合程度得到顯著增加,說明該樣品很可能含某種摻假成分。此時Adulterant Screen算法將提取出來摻假成分光譜,且與“摻假物模型”的光譜擬合程度明顯增加,說明該嬰幼兒配方奶粉樣品存在摻假物成分,并同時給出置信度指標(biāo)。

圖1 66個嬰幼兒配方奶粉樣品疊加近紅外光譜圖Fig.1 Superimposed near-infrared spectrogram of 66 infant formula samples

圖2 6種非法添加物疊加近紅外光譜圖Fig.2 Near infrared spectra of 6 kinds of illegal additives

空白樣品及單組分摻假樣品的鑒別結(jié)果如表1,從表1可以看出,所有待測樣品經(jīng)Adulterant Screen法計算處理后,均識別判斷為嬰幼兒配方奶粉樣品,因此軟件的第一步驗證全部是通過的,第二步驗證時,只有空白待測樣品驗證結(jié)果為通過,并能與嬰幼兒配方奶粉材料光譜匹配正常,其它均為驗證失敗,與嬰幼兒配方奶粉材料光譜匹配不正常,每種模擬摻假樣品的6平行樣品均能準(zhǔn)確的識別出各類摻假物且置信度都為“可能”,可以定義為本方法的檢出限,識別率為100%。同時,表1所示的結(jié)果識別濃度與模擬添加的濃度有所差異,這是因為建立摻假模型時,對摻假物濃度的估算是根據(jù)數(shù)據(jù)庫中摻假成分光譜與其在樣品光譜中的分量的相對強度,沒考慮有效光程的差異,因此為半定量估算結(jié)果,數(shù)據(jù)僅做參考。單組分摻假樣品的模擬摻假添加4個水平濃度(0.04%～1.0%),每種模擬摻假樣品的6平行樣品均能準(zhǔn)確的識別出各類摻假物且置信度都為“可能”以上,識別率為100%。

以摻假0.5%硫脲樣品為例的驗證結(jié)果:第一步驗證通過,說明該樣品為嬰幼兒配方奶粉,將摻假樣品光譜與標(biāo)準(zhǔn)樣品(材料光譜)的主成分(PCA)模型進(jìn)行比較,產(chǎn)生“擬合的摻假光譜圖”(圖3所示);第二步驗證失敗,因為樣品光譜與標(biāo)準(zhǔn)樣品(材料光譜)擬合產(chǎn)生較大的殘差,再將殘差光譜對該模型進(jìn)行擴(kuò)展,如果在模型中增加樣品殘差光譜后,樣品的殘差光譜與摻假物硫脲擬合程度得到顯著增加,說明該樣品很可能含有摻假成分,如圖4及圖5所示,此時軟件能快速準(zhǔn)確識別摻假物為硫脲,并給出置信度指標(biāo)為“很可能”,實現(xiàn)了摻假物有效的鑒別。

圖3 摻假0.5%硫脲樣品的擬合光譜圖Fig.3 Fitting spectrogram of adulterated 0.5% thiourea sample

圖4 摻假0.5%硫脲樣品的殘留光譜圖Fig.4 Residual spectrogram of 0.5% thiourea adulterated samples

圖5 摻假0.5%硫脲樣品的光譜圖Fig.5 Spectrogram of adulterated 0.5% thiourea sample

無摻假樣品的驗證結(jié)果:第一步驗證通過,表示該物質(zhì)為嬰幼兒配方奶粉樣品,將摻假樣品光譜與標(biāo)準(zhǔn)樣品(材料光譜)的主成分(PCA)模型進(jìn)行比較,產(chǎn)生“擬合的摻假光譜圖”(圖6所示);第二部驗證通過,即樣品光譜與標(biāo)準(zhǔn)樣品(材料光譜)擬合產(chǎn)生極小的殘差,沒有明顯跡象表明該樣品中含有未被擬合的異常成分,如圖7,表明該物質(zhì)沒有任何摻假成分。

圖6 無摻假樣品的擬合光譜圖Fig.6 Fitting spectra of unadulterated samples

圖7 無摻假樣品的殘留光譜圖Fig.7 Residual spectrogram of unadulterated samples

2.2 二組分摻假樣品的鑒別結(jié)果與分析

二組分摻假嬰幼兒配方奶粉樣品的6個組合,3個摻假添加水平濃度的樣品,每個組合的每個添加水平均做6次平行測試,故模擬摻假樣品共18組108個樣品。鑒別方法與單組分摻假樣品同理。二組分摻假樣品的鑒別結(jié)果如表2。

在18組108個樣品識別數(shù)據(jù)中,3個組合的3個摻假添加水平濃度9組54個數(shù)據(jù)識別完全正確,3個組合其中2個高濃度摻假添加水平36個數(shù)據(jù)識別完全正確,占總數(shù)比例為83.3%;有 3 組合最低濃度摻假添加水平18數(shù)據(jù)只能識別出其中一個組分,占比總數(shù)的 16.7%;從二組分的識別結(jié)果可知,Adulterant Screen 算法對二組分摻雜識別效果比單組分的差,且低濃度的識別能力弱。

2.3 三組分摻假樣品的鑒別結(jié)果與分析

三組分摻假嬰幼兒配方奶粉樣品共4種摻假組合:三聚氰胺+雙氰胺+雙縮脲、雙縮脲+環(huán)丙氨嗪+雙氰胺、尿素+三聚氰胺+硫脲、尿素+硫脲+環(huán)丙氨嗪,摻假添加濃度水平2個:0.2%、0.5%,每個濃度水平做6次平行測試,共8組48個模擬摻假樣品。識別結(jié)果見表3。在 8 組三組分48個識別數(shù)據(jù)中,4 組24個數(shù)據(jù)識別完全正確,占總數(shù)比例為50%,其中包括添加濃度0.2%、0.5%各兩組;有4組24數(shù)據(jù)能正確識別出其中兩個組分,其中包括0.2%添加濃度的2組、0.5%添加濃度的2組,占比總數(shù)的50%;一組分識別正確和三個組分均未能識別的個數(shù)為零。從三組分的識別結(jié)果可知,摻假物濃度越高,識別率也會越高,這說明Adulterant Screen算法對三組分低濃度的摻雜識別效果有所欠缺。

表2 二組分摻假樣品的鑒別結(jié)果(n=6)Table 2 Identification results of two-component adulterated samples(n=6)

表3 組分摻假樣品的鑒別結(jié)果Table 3 Identification results of three-component adulterated samples

2.4 無摻假樣品的鑒別結(jié)果分析

12個無摻假嬰幼兒配方奶粉中,正確識別出無摻假物的有9個,識別率為75%;識別出為其他摻假物,置信度為“不太可能”的有3個,占比25%,由識別給出置信度可知,3個均為檢出限以下,因此,可以判定無摻假嬰幼兒配方奶粉在檢出限以上的準(zhǔn)確識別率為100%。

3 結(jié)論

以16個品牌100個嬰幼兒配方奶粉樣品及6種非法添加物為對象,基于近紅外光譜技術(shù)及Adulterant Screen算法建立了嬰幼兒配方奶粉中非法添加物的快速鑒別方法,其中Adulterant Screen算法不僅保留了SIMCA等非靶向化學(xué)計量學(xué)方法的優(yōu)勢,不需要耗時建立偏最小二乘(PLS)或其他化學(xué)計量學(xué)校正模型,通過簡單的調(diào)整即可,而且通過潛在摻假成分光譜數(shù)據(jù)庫獲得了更高的靈敏度[20]。實驗結(jié)果表明,對于單組份摻雜嬰幼兒配方奶粉的識別最低檢出濃度為三聚氰胺0.04%、環(huán)丙氨嗪為0.05%,尿素、雙縮脲及硫脲為0.1%,雙氰胺為0.2%。對于二組分和三組分摻假奶粉在兩倍到十倍檢出限濃度的準(zhǔn)確識別率分別達(dá)到了83.3%和50%,摻假物濃度越高,識別率也會越高,對無摻假未知樣品的識別率100%。同時,該鑒別模型可以通過一個模型即可實現(xiàn)快速鑒別多個非法添加物。另外,收集的6種含氮的非法添加物具有較相似的氨基(-NH2)及氰胺等化學(xué)基團(tuán),因此具有較相似的近紅外光譜圖,如果多種非法添加物在待測樣品中混合存在時,大大的增加了識別難度,甚至無法正確識別出摻假物,故此模型對二組分和三組分摻假奶粉的摻假識別率較差。

利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合Adulterant Screen算法建立的嬰幼兒配方奶粉中非法添加物的快速鑒別方法,為嬰幼兒配方奶粉摻假鑒別提供了一種操作簡單、快速、可靠、便捷且樣品無損的鑒別方法,能有效的運用于嬰幼兒配方奶粉摻假鑒別的日常檢測工作,為嬰幼兒配方奶粉的檢測和監(jiān)管提供強有力的技術(shù)支持。