田 敏,馮 震3,曲瑞丹2,*,黃 靜,戚稼禹,曹 杰

(1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200241;2.上海城建職業(yè)學(xué)院健康與社會關(guān)懷學(xué)院,上海 201415;3.上海市食品藥品檢驗所,上海 201203)

蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶是一種新型的脫酰胺酶,能夠通過脫酰胺作用,增加蛋白質(zhì)的負(fù)電荷,極大地改善蛋白質(zhì)的溶解性、發(fā)泡性以及乳化性等功能特性。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶特異性強(qiáng),主要作用于大分子蛋白質(zhì),且不會引起蛋白質(zhì)的水解以及蛋白質(zhì)交聯(lián)等不良副反應(yīng),避免蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞和風(fēng)味的變化[1]。近年來,蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶倍受關(guān)注,但對其研究主要集中在結(jié)構(gòu)、應(yīng)用及安全性等方面[2-7],而對其產(chǎn)生菌株以及菌株多樣性的研究鮮見,且目前已報道的菌株產(chǎn)酶能力較低[8],不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

中國地域遼闊,資源豐富,本研究從采集自全國16個省、直轄市的799份土壤樣品中,篩選獲得206株具有產(chǎn)生蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶能力的菌株,并結(jié)合菌株形態(tài)特征、生理生化特征進(jìn)行分型分析。在2007年,有學(xué)者[9]對產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的解朊金黃桿菌進(jìn)行了致病性和毒性分析,結(jié)果表明該菌無致病性和毒性,可應(yīng)用于食品工業(yè)。因而本研究將著重對其中的33株解朊金黃桿菌進(jìn)行研究,了解其菌株之間的差異,分析其差異與其生存環(huán)境等之間的關(guān)系,為分離篩選高產(chǎn)的解朊金黃桿菌野生菌株提供有效的信息。

目前關(guān)于細(xì)菌分子分型方法較多,主要包括限制性核酸片段長度多態(tài)性(RFLP)[10]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)[11-13]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)[14]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)[15]、腸桿菌重復(fù)性基因組常見一致序列(ERIC-PCR)[16-17]和RiboPrinter全自動核糖體RNA基因指紋圖譜分型[18-19]等多種技術(shù)。ERIC片段最初是在腸道菌基因組中發(fā)現(xiàn)的,長約124～127 bp,其中有一段長約40 bp的核心序列,根據(jù)其核心區(qū)域設(shè)計一對反向引物,因其引物較長(22 bp),所以較其他基于PCR的分子分型方法,可得到特異性和重復(fù)性更高的DNA指紋圖譜。全自動核糖體分型方法是杜邦公司研發(fā)的一款全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng),該技術(shù)主要原理是細(xì)菌核糖體基因在進(jìn)化中相對保守,通過使用限制性內(nèi)切酶對菌株基因組進(jìn)行消化,電泳轉(zhuǎn)膜,探針雜交,可得到一系列特異性高的指紋圖譜。

本研究結(jié)合ERIC-PCR分型和全自動核糖體分型兩種不同的方法對來自不同地理環(huán)境的解朊金黃桿菌進(jìn)行多態(tài)性分析,分析菌株的差異與采樣環(huán)境以及菌株產(chǎn)酶能力之間的關(guān)聯(lián),以期為高效篩選產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶野生株提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

206株產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株 由華東師范大學(xué)微生物實驗室從采集自全國各地的799份新鮮土壤樣品分離獲得，其中的33株解朊金黃桿菌菌株基本信息見表1;胰蛋白胨 上海生物工程有限公司;酵母粉 OXOID;多聚蛋白胨 日本制藥株式會社;細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒 上海天根生化科技有限公司;瓊脂糖 上海生物工程有限公司;細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′;下游引物1492R:5′-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3′)，Eric分型引物參照文獻(xiàn)[20]設(shè)計Eric分型引物(Eric-F:5 ′-ATGTAAGCTCCTG GGATTCAC-3,Eric-R:5′-AAGTAAGTGACTG GGGTGAGCG-3′) 由泓訊生物科技有限公司合成。

立式大容量全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚有限公司;超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;PCR儀器 美國Bio-rad公司;Nanodrop 2000微量分光光度計 美國Thermo公司;凝膠電泳成像系統(tǒng) 上海天能科技公司;RiboPrinter全自動微生物指紋鑒定系統(tǒng) 美國Dupont公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 挑取36株產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶分離株單克隆接種于裝有25 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中,30 ℃、200 r/min,振蕩培養(yǎng)12 h,取1 mL菌懸液于1.5 mL EP管中,4 ℃,10000 r/min,離心5 min,棄上清,收集菌體,進(jìn)行后續(xù)基因組提取。基因組抽提具體步驟參照TAKARA基因組DNA抽提試劑盒說明書完成。然后,用核酸/蛋白濃度檢測儀測定所提取的基因組濃度,并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測提取效果。

1.2.2 16S rDNA序列測定及分析 PCR反應(yīng)體系為25 μL,引物各1 μL,1 μL的DNA稀釋液,預(yù)混液12.5 μL,補(bǔ)充9.5 μL ddH2O 至終體積為25 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min,30 個循環(huán)(94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,于紫外凝膠成像儀下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 ERIC-PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為2×Taq PCR StarMix 10 μL,模板DNA 1 μL,ERIC上游引物1 μL,ERIC下游引物1 μL,補(bǔ)ddH2O至終體積為20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性7 min,94 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,65 ℃延伸8 min重復(fù)30個循環(huán),最后,65 ℃再延伸16 min,以確保反應(yīng)充分。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條件:1%瓊脂糖凝膠,電壓100 V,時間1 h。經(jīng)凝膠呈像后,用Gel-Pro analyzer 4.0凝膠定量分析軟件進(jìn)行擴(kuò)增條帶分析,特定位點有條帶記為1,無條帶記為0,采用NTsys 2.10e軟件中的非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

1.2.4 全自動核糖體分子分型 將甘油保存已鑒定的33株解朊金黃桿菌菌種在LB平板分離純化(四區(qū)劃線),30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h,長出單克隆。用菌落采集棒蘸取少量單菌落,將細(xì)菌加入含有40 μL樣本緩沖液的微量離心管中,用移液器吹打混勻,形成菌懸液。將30 μL菌懸液加入到Riboprinter樣本管中,放入配套熱處理儀進(jìn)行滅活,處理約30 min。向熱處理后的樣本中加入裂解液A和裂解液B各5 μL,制成上樣液。打開儀器,進(jìn)行程序自檢,設(shè)置操作程序和參數(shù),在指定位置安裝酶管(PvuⅡ)、尼龍膜、1%瓊脂糖凝膠盒、基質(zhì)盒、純凈水、樣品盛放管,放置完畢后啟動程序。菌株分型結(jié)果的圖譜在BioNumerics軟件中采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

1.2.5 菌株產(chǎn)酶能力的測定 將33株解朊金黃桿菌挑單克隆接種于種子培養(yǎng)基,30 ℃,200 r/min,振蕩培養(yǎng)12 h。復(fù)蘇后的種子液吸取600 μL接種于裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,30 ℃,200 r/min,培養(yǎng)12 h。酶活性測定方法:100 μL含10 mmol/L Cbz-Gln-Gly磷酸鈉緩沖液,與10 μL發(fā)酵上清液混合均勻,37 ℃溫育30 min,然后加入100 μL 12%三氯乙酸終止反應(yīng);對照組先加入100 μL三氯乙酸,終止時加入100 μL底物溶液。根據(jù)盧玉棋[21]等的方法檢測上清液中單位酶活。

圖2 分離產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株和相關(guān)菌株16S rDNA基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree establishment of protein-glutaminase producing isolates and relation strain 16S rDNA gene sequences注:虛線框中菌株均為本實驗室從土壤中篩選的產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶野生株, 其中X代表33株解朊金黃桿菌,基本信息如圖2左上角表中所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株全國不同地區(qū)分布狀況分析

從來自全國18個省、市、自治區(qū)的土壤樣品中分離獲得206株產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的菌株,結(jié)合土壤樣品采集地,分析富集篩選效率,結(jié)果如圖1所示,不同地區(qū)分離篩選到菌株的陽性率差異較大,其中,采集自上海的土壤樣品陽性率最高,可以達(dá)到46%,其次為來源于河南的土壤樣品,陽性率為37%,此外,盡管陽性率較低,但在我國的四川、安徽等地同樣篩選獲得產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶野生株。

圖1 產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株 在全國不同地區(qū)的分布狀況Fig.1 The distribution of protein-glutaminase producing strains in different regions of China注:陽性率是指篩選到產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株的百分比, 即產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株數(shù)量/總菌株數(shù)量;顏色由淺到深陽性率從0～50%。

2.2 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特以及酶產(chǎn)量,從分離篩選的206株產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶野生株挑選出36株作為代表菌株,進(jìn)行16S rDNA序列測定,構(gòu)建了36株菌和部分相關(guān)種模式株16S rDNA 基因序列在內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示,結(jié)果表明,其中3株產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌,為條件致病菌。另外33株為解朊金黃桿菌,該菌株在2007年,已對產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的解朊金黃桿菌進(jìn)行了致病性和毒性分析[9],結(jié)果表明該菌無致病性和毒性,可應(yīng)用于食品工業(yè),因而后續(xù)將重點對該33株解朊金黃桿菌進(jìn)行分型分析。Q1、Q2、Q4、Q5等33株菌與安全性較高的模式菌株Chryseobacteriumproteolyticum聚為一個類群,QRD12462、QRD121161兩株菌則可聚類為Chryseobacteriumindologenes,菌株CMJ01105可聚類到Chryseobacteriumculicis。

表1 33株解朊金黃桿菌分離株的菌株來源信息Table 1 Information of 33 Chryseobacterium proteolyticum isolates

2.3 ERIC-PCR分子分型

從ERIC-PCR擴(kuò)增圖譜結(jié)果如圖3所示,33株解朊金黃桿菌可擴(kuò)增出3～9條大小位于100～10000 bp之間的片段,其中1300、600、550 bp這三個條帶為所有菌株共有的條帶,其余為特異性條帶。泳道11、15、23、24、26泳道的菌株的指紋圖譜帶型差異最大,呈現(xiàn)出明顯的DNA多態(tài)性。解朊金黃桿菌的ERIC-PCR指紋圖譜的聚類學(xué)分析結(jié)果如圖4所示,在相似性水平為75%時,將33株解朊金黃桿菌分為2個簇群,在圖右側(cè)分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ族群。根據(jù)菌株生存地理環(huán)境進(jìn)行分析,結(jié)果如表2，菌株Q4,Q5,Q7,Q8,Q9,Q10,Q11,Q12均來自上海,這9株解朊金黃桿菌分離自上海土壤樣品,均聚類于族群Ⅰ。聚類于族群Ⅱ的菌株,除菌株Y8分離自四川的土壤樣品以外,其余全部是分離自河南省的土壤樣品,這表明解朊金黃桿菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系上與地理環(huán)境存一定的關(guān)聯(lián)。

圖3 解朊金黃桿菌ERIC-PCR結(jié)果圖Fig.3 Chryseobacterium proteolyticum ERIC-PCR results注:從左至右依次為Marker:DL10000 Marker;1～33號泳道為來自不同地區(qū)的 解朊金黃桿菌(具體菌株標(biāo)號信息見表1)。

2.4 全自動核糖體分子分型結(jié)果

本文采用PvuⅡ限制性內(nèi)切酶,通過RiboPrinter系統(tǒng),將33株解朊金黃桿菌進(jìn)行核糖體分型,如圖5所示,每個菌株都會產(chǎn)生特征性條帶型。通過與杜邦鑒定數(shù)據(jù)庫中的解朊金黃桿菌條帶比較,33株分離菌株中相似性均在0.90以上,系統(tǒng)判定33株菌株均為解朊金黃桿菌。雖然33株菌株都是解朊金黃桿菌,但在指紋圖譜上仍可觀察到菌株之間的條帶差異。以相似性水平為92%時,可將33株解朊金黃桿菌分為兩個簇群。結(jié)合菌株生存地理環(huán)境進(jìn)行分析,結(jié)果如表3:分離自上海的解朊金黃桿菌基本全部位于第Ⅰ族群,第Ⅱ族群中除Y8分離自四川省綿陽市、Q7分離自上海市外,其余解朊金黃桿菌全部分離自河南省。這一結(jié)果與ERIC-PCR分型基本一致,均說明了解朊金黃桿菌的遺傳進(jìn)化與地理環(huán)境存在一定關(guān)聯(lián)。

表2 采用ERIC-PCR分型技術(shù)分析解朊金黃桿菌分型分布情況Table 2 Analysis of Chryseobacterium proteolyticum type distribution using ERIC-PCR

表3 采用全自動核糖體分型技術(shù)分析解朊金黃桿菌分型分布情況Table 3 Analysis of Chryseobacterium proteolyticum type distribution using automatic ribotyping

圖4 ERIC-PCR聚類分析圖Fig.4 ERIC-PCR clustering analysis

2.5 菌株產(chǎn)酶能力與分型結(jié)果相關(guān)性分析

通過ERIC-PCR分型方法和全自動核糖體分型方法對33株解朊金黃桿菌進(jìn)行遺傳多樣性研究,結(jié)果表明33株解朊金黃桿菌存在遺傳進(jìn)化上存在差異。張艷芳等[22]從全國25個省、直轄市采集土樣,分離出456株產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株,其中酶活高于0.5 U/mL的菌株僅占2.85%。本研究通過對33株解朊金黃桿菌的產(chǎn)酶能力進(jìn)行分析,探究解朊金黃桿菌產(chǎn)酶能力與采樣環(huán)境之間的聯(lián)系,結(jié)果如圖5所示,在第Ⅰ簇群中菌株單位酶活大部分低于0.5 U/mL,而第Ⅱ簇群的菌株單位酶活大部分在0.5 U/mL以上,占該族群菌株數(shù)的95.23%,占解朊金黃桿菌總菌株數(shù)的60.60%,篩選到高產(chǎn)菌株的概率大大提高。同時,該族群Ⅱ中90.48%菌株采樣來自河南省地區(qū),因而推測高產(chǎn)菌株的分布可能與地理環(huán)境存在一定關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

圖5 全自動核糖體分型聚類分析圖Fig.5 Automatic ribotyping clustering analysis注:以酶活為0.5 U/mL作為PG酶活高低差異性的分界線。

本文從來自全國不同地區(qū)的土壤樣品中篩選到206株產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的菌株,并通過16S rDNA鑒定,其中33株為食品安全菌株解朊金黃桿菌。通過結(jié)合傳統(tǒng)的ERIC-PCR分型方法和全自動核糖體分型方法對33株來自土壤的解朊金黃桿菌野生菌株進(jìn)行分子分型,ERIC-PCR指紋圖譜的聚類學(xué)分析結(jié)果顯示,33株解朊金黃桿菌分為2個簇群,且聚類于族群Ⅰ的菌株全部來源于上海的土壤樣品,而族群Ⅱ基本來源于河南的土壤樣品。而核糖體分型結(jié)果也與ERIC-PCR分型結(jié)果一致。一定程度上表明解朊金黃桿菌的遺傳多樣性豐富,可能與菌株來源的地理環(huán)境多樣性存在聯(lián)系。為了高效準(zhǔn)確篩選獲得高產(chǎn)目的菌株,本研究分析菌株產(chǎn)酶能力與分子分型之間的關(guān)聯(lián),結(jié)果表明,ERIC-PCR分型方法和全自動核糖體分型聚類于第Ⅱ簇群的菌株產(chǎn)酶能力普遍高于族群Ⅰ,結(jié)合不同族群菌株來源地理環(huán)境,推測菌株產(chǎn)酶能力可能與所處地理環(huán)境存在緊密關(guān)聯(lián)。

為了找到滿足工業(yè)化生產(chǎn)的菌株,常常需要從自然環(huán)境中分離出大量菌株進(jìn)行篩選。對于這些菌株的特性與功能需要逐個研究,同時在同一份土壤中分離出的菌株遺傳相似性很高,其中大多數(shù)來自同一個克隆,因此對于同一個分離樣品中微生物的多樣性分析對功能性菌株的快速篩選就變得非常重要。傳統(tǒng)微生物的分型一般是以菌株的表性特征進(jìn)行劃分,如血清型、毒性、生化鑒定等,但這些鑒定標(biāo)準(zhǔn)易受環(huán)境因素干擾,影響了菌株分型的準(zhǔn)確性[23]。隨著分子分型技術(shù)的發(fā)展,分子生物學(xué)分型方法被科研人員廣泛使用,使傳統(tǒng)方法的不足得到彌補(bǔ)。與此同時,分子分型技術(shù)操作簡單快捷,區(qū)分指數(shù)較高[24]。

腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列擴(kuò)增(ERIC-PCR)是日常實驗室進(jìn)行細(xì)菌分型分種的一種常見方法。1990年,Sharples等[25]首次在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)在其ds的3′末端區(qū)存在ERIC片段,后將該片段命名為“基因間重復(fù)單位”序列。Versaloviv等[26]根據(jù)ERIC的核心序列設(shè)計了一對反向引物,在進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增時,兩個相鄰ERIC保守序列之間的區(qū)域就擴(kuò)增出來,因為不同的細(xì)菌基因組上的ERIC重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同,最終就形成很多大小不同的DNA擴(kuò)增片段,構(gòu)成菌株的指紋圖譜。自動化核糖體基因分型系統(tǒng)(Riboprinter)是基于分子生物學(xué)的知識,對微生物進(jìn)行進(jìn)化分型的常用工具[27-28]。由于金黃桿菌菌株間差異較小,所以準(zhǔn)確且靈敏的菌株區(qū)分方法對于解朊金黃桿菌的分類鑒定非常重要。雖然結(jié)果表明兩種分型方法聚類結(jié)果大體一致,但核糖體分型方法的分辨能力更高。由于部分解朊金黃桿菌在親緣關(guān)系上存在高度同源,ERIC-PCR分型無法精確地對菌株之間的細(xì)微差異做出分辨,然而,全自動核糖體分型技術(shù)借助先進(jìn)的儀器設(shè)備,可對菌株之間的微弱差異做出分辨。綜合考慮分型技術(shù)的分辨率,精確率,實驗耗材費(fèi)用等,在早期實驗,可以采用ERIC-PCR進(jìn)行細(xì)菌分型實驗。由于全自動核糖體分型技術(shù)的儀器設(shè)備較為昂貴,不便于在實驗室大規(guī)模推廣使用,可以采用ERIC-PCR分型確定菌株存在差異后,再用全自動核糖體分型技術(shù)對菌株進(jìn)行精確的比較分型。

通過ERIC-PCR分型和全自動核糖體聚類分型,可進(jìn)一步對同一種屬的菌株種進(jìn)行遺傳差異性分析,同時,其遺傳分群與菌株采樣地理環(huán)境存在一定的聯(lián)系。從核糖體分型結(jié)果可以看出,來自河南地區(qū)的土壤樣品中分離的解朊金黃桿菌與其他地區(qū)分離株相比其產(chǎn)酶能力比較高,推測菌株的產(chǎn)酶能力與菌株采集地存在一定關(guān)聯(lián)。結(jié)合菌株遺傳分群與地理來源的關(guān)系,對采集自河南的樣本分析,本研究中河南的土樣主要來自于周口、開封等豫東地區(qū)的多個區(qū)縣,研究報道[29]豫東平原屬于鹽堿土質(zhì),因而,推測可能是因為解朊金黃桿菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶可以作用于蛋白質(zhì),釋放出游離氨分子,使環(huán)境堿度增加,在堿性較高的土壤中解朊金黃桿菌表現(xiàn)對強(qiáng)堿的耐受性,故菌株產(chǎn)酶能力較高。但由于本研究中菌株數(shù)量和來源有限,對于菌株采集環(huán)境與產(chǎn)酶能力之間的聯(lián)系有待進(jìn)一步驗證。但是,目前該結(jié)果已初步表明高產(chǎn)菌株的遺傳族群與地理來源存在一定的關(guān)聯(lián),這為以后根據(jù)采樣環(huán)境來高效篩選高產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶野生株提供了新思路。