劉存芳,史 娟,劉軍海,張 強(qiáng),杜全超,王 偉,田光輝

(陜西理工大學(xué)陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西漢中 723000)

玫瑰紅景天(RhodiolaroseaL.)是景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)的一種多年生草本植物,又稱(chēng)為薔薇紅景天[1],多野生于林地、山坡、干燥的石縫隙、陡巖間等地方[2],分布于我國(guó)東北、華北、西北等山區(qū)。明代李時(shí)珍在《本草綱目》中記載玫瑰紅景天為“本經(jīng)上品,祛邪惡氣”,被稱(chēng)為“仙賜草”,有玫瑰香味,新鮮時(shí)更濃郁,全草均可藥食兩用,常用根莖,性“甘、苦,平,歸肺、心經(jīng)”[3],味微苦、酸澀,其功能主要為活血止血、化瘀消腫、抗炎、抗缺氧、抗疲勞、抗抑郁、抗過(guò)敏、抗輻射、抗癌等[4-5],常用于治療嘔血、咳血、高血壓、冠心病等病癥[6],有“扶正固本”的作用[7]。人們對(duì)玫瑰紅景天的生物活性以及其活性成分不斷地進(jìn)行著研究[8-9],紅景天中的活性成分豐富多樣,含有紅景天苷(salidroside)及其苷元酪醇(ptyrosol)、酪薩維(rosavin)、絡(luò)塞琳(rosarin)、絡(luò)塞(rosin)等[10-11],還含有6′-O-沒(méi)食子酰-紅景天苷、對(duì)-O-β-吡喃葡萄糖基-苯丙烯酸、7-甲氧基香豆素等多種化合物[12],另有文獻(xiàn)報(bào)道采用微波技術(shù)從玫瑰紅景天中提取總黃酮和多糖,并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定[13-14]。玫瑰紅景天中揮發(fā)性物質(zhì)的研究尚少[15-16],對(duì)其揮發(fā)性物質(zhì)的活性研究更少,對(duì)紅景天同屬植物如大花紅景天[17]、高山紅景天[18]、小叢紅景天[19]、狹葉紅景天[20]等的揮發(fā)性物質(zhì)研究較多[21],也有對(duì)紅景天屬植物揮發(fā)性物質(zhì)活性的研究報(bào)道[18,20]。紅景天揮發(fā)性物質(zhì)有諸多特殊的活性如抗菌、抗炎、抗氧化等,可用于醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)等領(lǐng)域,開(kāi)發(fā)紅景天揮發(fā)性物質(zhì)前景廣闊。

本研究以玫瑰紅景天為原料,采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性物質(zhì),用GC-MS和GC分離定性,進(jìn)行體外抗氧化和抗菌活性試驗(yàn),旨在為綜合利用玫瑰紅景天這一珍稀野生藥食兼用植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰紅景天(RhodiolaroseaL.) 2017年11月上旬收集于西藏林芝山區(qū),全草經(jīng)陜西理工大學(xué)省級(jí)植物學(xué)科負(fù)責(zé)人趙樺教授鑒定和確認(rèn),實(shí)驗(yàn)用其新鮮的根莖;系列正構(gòu)烷烴物質(zhì)(C6～C23) 為色譜純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司(進(jìn)口分裝);實(shí)驗(yàn)所用其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純,西安化學(xué)試劑廠;肉湯培養(yǎng)基、水解酪蛋白胨(MH)肉湯、普通瓊脂平板培養(yǎng)基等 北京索萊寶科技有限公司;試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干品 中國(guó)食品藥品檢定研究院中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心;pH7.4的150 mmoL/L PBS緩沖溶液、濃度為1.5 mmoL/L鄰二氮菲溶液、1.5 mmoL/L硫酸亞鐵溶液、0.02%雙氧水溶液 現(xiàn)用現(xiàn)配;水 為二次蒸餾水。

Finnigan-Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國(guó)熱電公司,配有DB-5型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);Agilent 6890N氣相色譜儀(GC) 美國(guó)安捷倫利科技有限公司,配有HP-5型色譜柱(5% Phenyl Methyl Siloxane,capillary:30.0 m×320 μm×0.25 μm);96孔培養(yǎng)板 美國(guó)康寧公司;UV-6300PC紫外可見(jiàn)光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;普通培養(yǎng)箱 上海風(fēng)棱實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;BSA224S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;中藥材粉碎機(jī) 廣州賽豪機(jī)械有限公司;水蒸氣蒸餾裝置、玻璃器皿 天津化玻科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的提取 將玫瑰紅景天的根莖陰干,用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)50目篩,粉末密封保存。稱(chēng)取100.0 g粉末于蒸餾瓶中加入等質(zhì)量的水浸泡過(guò)夜后安裝水蒸氣蒸餾裝置,提取揮發(fā)性物質(zhì)8 h,餾出液加入氯化鈉形成飽和溶液再用乙醚萃取三次,合并萃取液加入無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜,在40 ℃水浴中蒸餾回收乙醚[22],得到淡黃色油狀有香味的揮發(fā)性物質(zhì)1.98 g,得率為1.98 g/100 g。重復(fù)提取三次,密封0～5 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀工作條件 色譜條件:載氣He氣,柱溫50～280 ℃,初始溫度設(shè)定50 ℃,保持3 min后,用程序升溫10 ℃/min,溫度至180 ℃保持4 min,再以10 ℃/min升溫至250 ℃,保持3 min;色質(zhì)界面溫度250 ℃,衡流模式,進(jìn)樣量0.5 μL,流量1 mL/min,分流比50∶1。質(zhì)譜條件:離子源溫度設(shè)定250 ℃,電離能量為70 eV,倍增器電壓為978 V,離子源為EI,掃描范圍45～500 m/z。

1.2.3 保留指數(shù)的確定 通過(guò)GC用系列正構(gòu)烷烴物質(zhì)的混合物(C6～C23)來(lái)確定揮發(fā)性物質(zhì)中各個(gè)組分的Kovats保留指數(shù)RI值[23],GC工作條件同1.2.2中的色譜條件。

1.2.4 對(duì)羥基自由基清除率的測(cè)定 通過(guò)H2O2/Fe2+體系測(cè)定清除羥基自由基·OH的效果[24],將玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)配制成0.1 mg/mL的溶液,取8支10 mL規(guī)格的具塞比色管,逐個(gè)移入1 mL鄰二氮菲溶液、3.0 mL PBS溶液,振蕩混勻,再分別加入2 mL硫酸亞鐵溶液,振蕩混勻,在6支比色管中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL不同梯度的玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)溶液,振蕩混勻,編號(hào)為1～6號(hào);另外2支比色管標(biāo)識(shí)為損傷管和未損傷管,不加玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)溶液,1～6號(hào)管和損傷管中再分別加入1 mL雙氧水溶液,未損傷管不加雙氧水溶液。在8支比色管中用水定容至10 mL,振蕩混勻,此時(shí)1～6號(hào)管中玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的濃度分別為0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012 mg/mL,放置于普通培養(yǎng)箱中設(shè)定溫度為37 ℃保溫反應(yīng)60 min,取出冷卻至室溫,用分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定8支比色管中溶液的吸光度A。以相同濃度的維生素C作為參照。重復(fù)測(cè)量三次,取平均值。

·OH的清除率(%)=(A2-A1)/(A0-A1)×100

式中:A0為未損傷溶液的吸光度;A1為損傷溶液的吸光度;A2為加玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)溶液的吸光度。

1.2.5 抗菌活性試驗(yàn) 體外抗菌活性的試驗(yàn)菌株為金黃色葡萄球菌ATTCC25925株、大腸桿菌ATCC25922株、腸炎沙門(mén)氏菌50040株、鼠傷寒沙門(mén)菌50013株、痢疾志賀氏菌CMCC51105株、福氏志賀氏菌CMCC51572和白色念株菌ATCC10231株,7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株。

表1 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組分Table 1 Chemical components of the volatile compound form Rhodiola rosea L.

菌液制備:將試驗(yàn)菌株在MH肉湯中接種后放置于普通培養(yǎng)箱內(nèi),控溫37 ℃培養(yǎng)24 h,光電比濁計(jì)數(shù)法確定細(xì)菌的數(shù)量。用MH肉湯培養(yǎng)液調(diào)制成106CFU/mL,將玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)溶于含5% Tween-80的肉湯中,連續(xù)二倍梯度稀釋后在96孔培養(yǎng)板以0.2 mL/孔注入不同濃度的玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)溶液,分別注入濃度為106CFU/mL的實(shí)驗(yàn)菌液50 μL/孔,設(shè)置空白對(duì)照,在濕盒內(nèi)放置水平再放進(jìn)微生物培養(yǎng)箱中控溫37 ℃下培養(yǎng)24 h,觀測(cè),沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)孔的最小玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)溶液的濃度為最小抑菌濃度MIC;在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上采用平板轉(zhuǎn)種法確定最小殺菌濃度(MBC)[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

色譜峰的質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)與NIST譜庫(kù)和WILEY譜庫(kù)中入庫(kù)譜圖進(jìn)行對(duì)比,相似度大于85%予以認(rèn)定,Kovats保留指數(shù)RI值以系列正構(gòu)烷烴為對(duì)照用色譜圖中兩邊相近的正構(gòu)烷烴進(jìn)行標(biāo)定[26],結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析來(lái)定性確定。將總離子流圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)用峰面積歸一化法確定玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)中各個(gè)組分的相對(duì)含量。

數(shù)據(jù)處理和圖形繪制用OriginLab Origin V 8.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)中的組分分析

用GC-MS對(duì)玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)分離的總離子流圖如圖1,檢出55個(gè)組分,各組分經(jīng)質(zhì)譜掃描所得的質(zhì)譜圖譜通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)檢索譜庫(kù),人工解析圖譜將各組分的質(zhì)譜碎片和文獻(xiàn)對(duì)比,結(jié)合相對(duì)豐度、質(zhì)荷比和基峰等,對(duì)各組分逐一進(jìn)行確認(rèn),從玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)中鑒定出53種化合物,鑒出化合物的相對(duì)含量占到總峰的98.35%,各組分結(jié)構(gòu)確定的結(jié)果如表1。表1中保留指數(shù)RI值是以系列正構(gòu)烷烴(C6～C23)作為對(duì)照品,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)中的各個(gè)組分的出峰時(shí)間可用色譜圖上兩邊相近的兩個(gè)正構(gòu)烷烴進(jìn)行標(biāo)定,保留值接近,測(cè)定的保留指數(shù)精確度較高相對(duì)偏差在0.1%～0.2%內(nèi),采用保留指數(shù)RI值能減少外部因素的影響,提高重現(xiàn)性和鑒定的效率。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的組分豐富多樣,以醇、醛、酚、酯和烷烴類(lèi)為主,還有烯烴、酸、酮、炔、酰胺和黃酮類(lèi),其中醇類(lèi)19種、醛8種,酚、酯和烷烴各5種,烯烴和羧酸各3種、酮2種、炔、酰胺和黃酮類(lèi)各1種。

圖1 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS總離子流圖Fig.1 TIC chromatograms of the volatile compound from Rhodiola rosea L.

續(xù)表

玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)中的主要組分是1-辛醇(1-Octanol,42.72%)、香葉醇((Z)-3,7-dimethyl-2,6-Octadien-1-ol,29.85%)、苯乙醇(Phenylethyl alcohol,9.67%)、桃金娘烯醇((-)-Myrtenol,2.69%)、芳樟醇(Linalool,1.89%),這5種化合物在玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)中的含量占到了總量的86.82%,其中1-辛醇和香葉醇的含量就占到了72.57%。1-辛醇有微甜的草香味是GB2760-86中允許使用的食用香料,也是重要的香料中間體,能被氧化成另一種天然產(chǎn)物辛酸[27];香葉醇有玫瑰香味,有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、平喘等廣泛的藥理活性[28];苯乙醇有清甜的玫瑰花香味,也是允許使用的一種天然食用香料,有抗菌、防腐、抑制心房肌肉收縮、抑制平滑肌收縮、緩和高血壓、支氣管平滑肌松弛等作用;桃金娘烯醇有清涼的檀木薄荷香氣,有抗炎、抗氧化作用,能治療急、慢性鼻炎、鼻竇炎以及急、慢性氣管炎和支氣管炎等;芳樟醇呈鈴蘭香味,有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、防止齲齒以及鎮(zhèn)靜等作用,廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、藥物合成中間體、精細(xì)化工等領(lǐng)域,這些較高含量的化合物均含有羥基,含羥基活性基團(tuán)的化合物往往是極性分子會(huì)表現(xiàn)出特殊的生理活性,預(yù)示著玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)有潛在的生物活性。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)中的主要組分和大花紅景天揮發(fā)油主要化學(xué)成分為1-辛醇、香葉醇等相似[17],和西藏紅景天揮發(fā)油主要成分為香葉醇、1-辛醇、芳樟醇、甲酸辛酯、桃金娘醇等基本一致[21],和文獻(xiàn)報(bào)道的5個(gè)種屬12個(gè)西藏紅景天樣品分析的結(jié)果基本相同[19],但主要化學(xué)成分及其含量也都存在著差異,這與品種、采樣季節(jié)和產(chǎn)地有關(guān)。

2.2 清除羥基自由基的效果

由圖2可知,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)在相同濃度下和維生素C相比,對(duì)H2O2/Fe2+體系中的羥基自由基清除率均要高,說(shuō)明對(duì)羥基自由基表現(xiàn)出明顯的清除效果。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的濃度和清除率存在著量效關(guān)系,隨著玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)濃度的增加對(duì)羥基自由基的清除率不斷增強(qiáng),均高于相同濃度維生素C對(duì)羥基自由基的清除率,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)及維生素C的半抑制濃度IC50分別為0.0073 mg/mL和0.0092 mg/mL,說(shuō)明玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)有明顯的抗氧化活性,是一種天然的抗氧化物質(zhì)。

圖2 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.2 Scavenging activity of the volatile compound form Rhodiola rosea L.on ·OH

2.3 抗菌活性

玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC和MBC如表2,從表2中結(jié)果可以看出,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)所選的7個(gè)菌株均有明顯的抑制效果,能抵抗這7個(gè)致病菌的侵染。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌ATTCC25925和大腸桿菌ATCC25922的MIC值分別是0.12和0.58 mg/mL,說(shuō)明對(duì)這兩個(gè)細(xì)菌有強(qiáng)烈的抑制作用;玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌50040、痢疾志賀氏菌CMCC51105、福氏志賀氏菌CMCC51572和白色念株菌ATCC10231的MIC值在2.02～9.02 mg/mL之間,表明玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)這些細(xì)菌也有明顯的抑制作用。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌ATTCC25925的MBC值是0.36 mg/mL,表明玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)該細(xì)菌有強(qiáng)烈的殺滅作用;對(duì)其他6個(gè)細(xì)菌的MBC值在1.90～11.34 mg/mL之間,說(shuō)明對(duì)這6個(gè)細(xì)菌也有明顯的殺滅作用。玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌ATTCC25925和大腸桿菌ATCC25922的抑制作用表現(xiàn)得更為強(qiáng)烈。

表2 玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì) 對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC值和MBC值(mg/mL)Table 2 MIC(mg/mL)and MBC(mg/mL)of the volatile compound form Rhodiola rosea L.on tested strains

3 結(jié)論

玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的主要組分有1-辛醇、香葉醇、苯乙醇、桃金娘烯醇、芳樟醇等,醇類(lèi)19種、醛8種,酚、酯和烷烴各5種,烯烴和羧酸各3種、酮2種,炔、酰胺和黃酮類(lèi)各1種,組分豐富多樣,與文獻(xiàn)報(bào)道的紅景天同屬其他植物揮發(fā)性物質(zhì)的組分有相似性,一些主要組分是一致的,這說(shuō)明物種與其化合物組成有相關(guān)性,但由于品種、采樣季節(jié)和產(chǎn)地的不同揮發(fā)性物質(zhì)的組分會(huì)存在差異,這意味著揮發(fā)性物質(zhì)的活性以及活性效果也會(huì)不同[22]。通過(guò)H2O2/Fe2+體系以維生素C為參照品來(lái)考察玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)羥基自由基的清除作用,與維生素C比較對(duì)羥基自由基的清除率要高,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)及維生素C的半抑制濃度IC50分別為0.0073和0.0092 mg/mL,表現(xiàn)出明顯的清除作用,對(duì)玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的抗氧化活性也進(jìn)行了初步試驗(yàn)。體外抗菌測(cè)試的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)結(jié)果表明,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)所選的7個(gè)菌株均有明顯的抑制效果,能有效地抵抗這7個(gè)致病細(xì)菌,對(duì)金黃色葡萄球菌ATTCC25925和大腸桿菌ATCC25922的抑制作用更為強(qiáng)烈,說(shuō)明玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)是一種有待開(kāi)發(fā)具有抗菌和抗氧化的天然活性物質(zhì),由于玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的組分種類(lèi)豐富多樣,其他抗氧化活性和抗菌活性的試驗(yàn)仍有研究的價(jià)值和意義,玫瑰紅景天揮發(fā)性物質(zhì)的抗氧化抗菌的機(jī)理以及其他活性試驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究。