賈萌，趙華聰，蔡淑慧，王洪蘭，趙曉莉，池玉梅，張雯，狄留慶

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023)

獨活為傘形科植物重齒毛當歸AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan的干燥根。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有祛風除濕、通痹止痛的功效[1]。獨活中的化學成分主要為香豆素類和揮發(fā)油類，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗血小板等藥理學活性[2]。獨活香豆素類成分研究較多，但由于當歸醇類成分多為同分異構(gòu)體，未見其具體定性及定量分析[3-6]。本文通過對照品指認出2種含量較高的當歸醇類(當歸醇A、當歸醇G)，并同時對二氫歐山芹素、當歸醇A、當歸醇G、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯6種成分進行定量分析。

獨活在羌活勝濕湯、獨活寄生湯及蠲痹湯中作為君藥發(fā)揮祛風止痛的作用，其質(zhì)量優(yōu)劣對臨床用藥的有效性和安全性有較大影響。目前市場上獨活藥材來源多為栽培品，主要種植產(chǎn)地有湖北、四川、重慶等[7]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)市場上獨活藥材質(zhì)量良莠不齊，且多數(shù)批次藥材剛符合或不符合藥典標準，從而造成炮制后的獨活飲片質(zhì)量達不到藥典標準，因此本實驗建立了獨活飲片指紋圖譜及多成分含量測定，能較為全面地對獨活飲片進行質(zhì)量控制，為獨活飲片質(zhì)量標準的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，Empower 3色譜數(shù)據(jù)工作站，PDA檢測器，美國Waters公司；XP-6型百萬分之一精密天平，瑞士梅特勒-托利多公司；萬分之一天平，上海精密科學儀器有限公司；超聲波清洗器，江蘇金怡儀器科技有限公司；CL21R微量離心機，美國賽默飛世爾科技公司；Milli-Q超純水儀，美國Merck Millipore公司。

1.2 試劑

二氫歐山芹素(批號：111554-201705)，購于上海源葉生物科技有限公司；當歸醇A(批號：B21614)、當歸醇G(批號：B20328)，購于南京森貝伽生物科技有限公司；二氫歐山芹醇乙酸酯(批號：17020903)，購于成都格利普生物科技有限公司；蛇床子素(批號：111554-201705)、異歐前胡素(批號：110827-201611)、二氫歐山芹醇當歸酸酯(批號：111554-201705)，購于中國食品藥品檢定研究院。質(zhì)量分數(shù)均大于98%。甲醇(分析純)，購于國藥集團化藥試劑有限公司；乙腈(色譜純)，購于美國天地有限公司；甲酸(色譜純)，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 飲片

15批不同產(chǎn)地獨活藥材，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學谷巍教授鑒定為傘形科植物重齒毛當歸AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan的干燥根。15批獨活飲片均由15批獨活藥材炮制而來，經(jīng)檢測符合藥典飲片項下標準，信息見表1。

表1 獨活藥材及飲片來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters SunFire C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序為：0～5 min,15%～20%A;5～20 min，20%～27%A；20～42 min，27%A；42～52 min，27%～30%A；52～53 min，30%～41%A；53～58 min，41%A；58～65 min，41%～50%A；65～88 min，50%～55%A；88～90 min，55%～15%A；90～95 min，15%A；檢測波長320 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為30℃，進樣體積10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取獨活粉末(過3號篩)約0.5 g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，14 000 r/min離心10 min，即得。

2.3 對照品溶液的制備

取二氫歐山芹素、當歸醇A、當歸醇G、二氫歐山芹醇乙酸酯、異歐前胡素、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成各對照品溶液。精密移取各對照品溶液適量，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為26.78、181.35、81.46、86.85、124.58、247.79、80.72 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 獨活飲片炮制工藝

2.4.1 炮制規(guī)范 參照《中國藥典》2015版一部獨活飲片項下及四部(0213炮制通則)[8-9]。

2.4.2 炮制工藝 取獨活藥材，除去泥沙、砂石等雜質(zhì)及非藥用部位，用流動的飲用水搶水洗凈，放于托盤中，采用悶潤法進行軟化處理，每300 g藥材每隔1 h噴淋適量水，藥材上部用潔凈濕潤的紗布覆蓋，共噴淋300 mL水，悶潤7 h至藥材內(nèi)外軟硬程度適宜后切薄片(1～2 mm)，于50 ℃鼓風干燥8～9 h，即得。

2.5 指紋圖譜方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取獨活飲片(批號:2019071610)，按“2.2”項下方法制備，并根據(jù)“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，計算HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結(jié)果表明，共有峰的相對保留時間RSD均小于0.05%，相對峰面積RSD均小于1.46%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取獨活飲片(批號:2019071610)，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，并根據(jù)“2.1”項下色譜條件，進樣測定，計算HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結(jié)果表明，共有峰的相對保留時間RSD均小于0.30%，相對峰面積RSD均小于2.96%，表明該方法重復性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取獨活飲片(批號:2019071610)，按“2.2”項下法制備，并根據(jù)“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，計算HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結(jié)果表明，共有峰的相對保留時間RSD均小于0.80%，相對峰面積RSD均小于3.05%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 指紋圖譜的建立及相似度評價

取獨活飲片，根據(jù)“2.2”項下方法制備15批獨活供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄HPLC色譜圖。導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)軟件進行分析，以獨活飲片(S01)為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，通過多點校正、全譜峰匹配，生成獨活對照圖譜(圖1)及15批獨活飲片指紋圖譜(圖2)。共標定出21個共有峰，經(jīng)過與對照品PDA光譜圖及保留時間對比，指認出7個色譜峰，分別為6號峰(二氫歐山芹素)、9號峰(當歸醇A)、12號峰(當歸醇G)、14號峰(二氫歐山芹醇乙酸酯)、18號峰(蛇床子素)、19號峰(異歐前胡素)、20號峰(二氫歐山芹醇當歸酸酯)。以獨活飲片對照圖譜為參照，15批獨活飲片(S01～S15)的相似度分別為0.888、0.884、0.897、0.986、0.978、0.858、0.971、0.864、0.891、0.960、0.973、0.971、0.900、0.974、0.962，相似度良好。

2.7 化學模式識別分析

2.7.1 聚類分析 將15批獨活飲片指紋圖譜的21個共有峰峰面積導入SPSS22.0軟件，采用平方Euclidean距離進行聚類分析，結(jié)果見圖3，當類間距離為15～20時，15批獨活飲片可分為3類，S9為Ⅰ類，S13為Ⅱ類，S1～S8、S10～S12、S14、S15為Ⅲ類。

2.7.2 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA) 以15批獨活飲片指紋圖譜的21個共有峰峰面積為變量，采用SIMCA 13.0軟件進行PLS-DA分析，結(jié)果見圖4，與聚類分析結(jié)果一致。通過VIP值篩選出影響獨活飲片成分差異的標志性成分，結(jié)果見圖5，以VIP值>1為篩選標準，標記出8個貢獻較大的成分，依次為6、16、10、3、13、4、14、19號色譜峰，并指認出其中的6號峰(二氫歐山芹素)、14號峰(二氫歐山芹醇乙酸酯)、19號峰(異歐前胡素)，導致了獨活飲片成分含量上的差異，因此在制定獨活飲片的質(zhì)量標準時，建議對獨活的多指標成分進行質(zhì)量控制。

2.8 多成分含量測定

2.8.1 系統(tǒng)適應性 取混合對照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，二氫歐山芹素、當歸醇A、當歸醇G、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間?；旌蠈φ掌啡芤杭肮┰嚻啡芤旱纳V圖見圖6。

2.8.2 線性關(guān)系考察 取不同梯度濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以各對照品峰面積(Y)為縱坐標，濃度(X，μg/mL)為橫坐標，得到各成分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表2。

2.8.3 精密度試驗 取同一批獨活飲片供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，計算各指標成分的含量RSD值。結(jié)果二氫歐山芹素、當歸醇A、當歸醇G、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯含量RSD分別為0.23%、0.24%、0.18%、0.20%、0.09%、0.10%，表明儀器精密度良好。

2.8.4 重復性試驗 取同一批獨活飲片，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，并根據(jù)“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算各指標成分的含量RSD值。結(jié)果二氫歐山芹素、當歸醇A、當歸醇G、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯含量RSD分別為1.77%、1.89%、1.65%、1.50%、1.62%、1.71%，表明該方法重復性良好。

2.8.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批獨活飲片供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，計算各指標成分的含量RSD值。結(jié)果二氫歐山芹素、當歸醇A、當歸醇G、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯含量RSD分別為0.51%、0.77%、0.56%、2.76%、0.73%、0.94%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8.6 加樣回收率試驗 精密稱取同一批已知含量的獨活飲片0.25 g，精密加入與獨活飲片含量各50%混合對照品溶液，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算各指標成分的平均加樣回收率。結(jié)果二氫歐山芹素、當歸醇A、當歸醇G、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯的平均加樣回收率分別為94.01%、93.57%、96.62%、97.69%、98.79%、96.42%，表明該方法回收率良好。

2.8.7 樣品測定 取15批獨活飲片，按“2.2”項下方法平行制備2份，連續(xù)進樣2針，并根據(jù)“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄樣品峰面積。通過各指標成分的線性方程，計算二氫歐山芹素、當歸醇A、當歸醇G、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯的含量，結(jié)果見表3。

表2回歸方程及相關(guān)系數(shù)

指標成分回歸方程相關(guān)系數(shù)R線性范圍/(μg·mL-1)二氫歐山芹素Y=53583X-207.40.99990.84～26.78當歸醇AY=20911X-79600.99995.67～181.35當歸醇GY=19996X+17131.00002.55～81.46二氫歐山芹醇乙酸酯Y=37789X-25831.00002.71～86.85蛇床子素Y=40422X+98740.99997.74～247.79二氫歐山芹醇乙酸酯Y=30547X-30740.99992.52～80.72

表3 15批獨活飲片中各成分的含量測定

3 討論

3.1 色譜條件

本實驗考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%甲酸幾種不同的流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，各色譜峰分離度及拖尾因子均較好，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相系統(tǒng)。通過HPLC全波長(210～400 nm)掃描分析，結(jié)果表明，在檢測波長320 nm下，獨活飲片色譜峰數(shù)目較多，能較為全面地體現(xiàn)出獨活中的化學成分信息，且香豆素類成分在該波長下有最大吸收，故選擇320 nm波長作為HPLC指紋圖譜及多成分定量的檢測波長。

3.2 供試品溶液的制備及指標成分的選擇

考察了不同提取方法(超聲、回流)、不同體積分數(shù)(50%、70%、100%)甲醇、不同提取時間(30、45、60 min)、不同料液比(0.5 g/25 mL、0.5 g/50 mL、0.5 g/100 mL)對獨活飲片的指紋圖譜及多成分含量的影響。以實驗簡便化、含量最優(yōu)化進行優(yōu)選，確定了提取方式為超聲，提取時間為30 min，料液比為0.5 g/50 mL，能夠?qū)ⅹ毣钪械幕瘜W成分盡可能提取出來。70%甲醇作提取溶劑時，能同時兼顧到獨活中的水溶性成分及脂溶性成分，且獨活中的香豆素類成分含量較高，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。香豆素類成分是獨活中的主要藥效物質(zhì)，其中二氫歐山芹素、當歸醇A、當歸醇G、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯在醇提液及水煎液中均有所體現(xiàn)，且含量較高，故選擇以上6種成分為定量指標，為后續(xù)獨活標準湯劑及復方制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。由于異歐前胡素在獨活中含量較低，僅對此作定性分析。

3.3 模式識別分析

聚類分析將15批獨活飲片分為3類，其中S9為為Ⅰ類，S13為Ⅱ類，其余為Ⅲ類。PLS-DA與聚類分析結(jié)果一致，均能對15批獨活飲片進行有效區(qū)分及聚類。通過VIP值篩選出8個標志性色譜峰，指認出二氫歐山芹素、二氫歐山芹醇乙酸酯、異歐前胡素3個色譜峰，通過多成分定量分析結(jié)果可知，S9、S13樣品的二氫歐山芹素、二氫歐山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯的含量與其它批次有差異，可能是造成其質(zhì)量差異并分類的依據(jù)。