張正光，劉冰，梁煒鋒，沈存思

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點實驗室，江蘇 南京 210029)

肝癌是我國乃至世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生存[1]。由于肝癌發(fā)病隱匿，許多肝癌患者在確診時已處于晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時段,即便進行手術(shù)治療，也難以取得良好治療效果。索拉非尼(Sorafenib)是目前臨床上用于治療晚期肝癌、腎癌的一線藥物[2-4]，是一種新型多靶點抑制劑。然而，Sorafenib的獲得性耐藥現(xiàn)象在臨床上普遍存在，使其應(yīng)用受到了極大限制[5]。因此，如何降低Sorafenib的耐藥性，是醫(yī)藥界治療中晚期肝癌亟待解決的問題。

槐耳顆粒由真菌類中藥槐耳經(jīng)過現(xiàn)代技術(shù)工藝加工研制而成，具有扶正固本，活血消癥的功效，常被用于不宜手術(shù)的原發(fā)性肝癌的治療，對化療藥起著增效減毒的作用[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，槐耳顆粒與Sorafenib聯(lián)合用藥相比單用Sorafenib治療晚期肝癌，其臨床療效有較大的提升，同時腹瀉、皮疹、惡心嘔吐等不良反應(yīng)有所改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[8]。此外，有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，槐耳具有部分逆轉(zhuǎn)諸如乳腺癌、肺癌、肝癌等癌癥多藥耐藥的功效[9-11]。然而，槐耳顆粒是否能夠逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對Sorafenib的獲得性耐藥，目前尚無文獻報道。本文通過初步探究槐耳顆粒對Sorafenib耐藥肝癌細(xì)胞BEL-7402/S的影響，為槐耳顆粒的臨床使用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞及藥物

BEL-7402細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；Sorafenib購于北京索萊寶生物科技有限公司(純度:99%)；槐耳顆粒購于啟東蓋天力藥業(yè)有限公司。

1.2 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液(上海源培生物科技有限公司)、胎牛血清(Gibco公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)(上海源培生物科技有限公司)、0.25%胰蛋白酶EDTA溶液(上海源培生物科技有限公司)、青霉素-鏈霉素雙抗(100×)(上海源培生物科技有限公司)、CCK-8(DOJINDO公司)、DMSO(BIOSHARP公司)、TRIzol?Reagent(Ambion公司)、5×All-In-One RT MasterMix(Abm公司)、EvaGreen 2× qRCR MasterMix(Abm公司)、RIPA裂解液(Beyotime公司)、ELC化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(通用型，50×)(Beyotime公司)、DEPC水(Beyotime公司)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)(Beyotime公司)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Beyotime公司)、HIF-1α抗體(Immunoway公司)、VEGF-A抗體(Immunoway公司)、β-actin抗體(Immunoway公司)、HRP Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Immunoway公司)。

1.3 儀器

超凈工作臺(ESCO公司，型號：ACB-4A1)、常溫離心機(Eppendorf公司，型號：5702)、倒置顯微鏡(Leica公司，型號：090-135.001)、三洋二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO公司，型號：MCO-20AIC)、Infinite多功能酶標(biāo)儀(TECAN公司，型號：M200 Pro)、梯度PCR儀(德國耶拿分析儀器股份有限公司，型號：Biometra Tone 96G)、定量PCR儀(Applied Biosystems By Life Technologies公司，型號：QuantStudio 7 Flex)、微孔板專用離心機(Eppendorf公司，型號：5430)、超聲波細(xì)胞裂解儀(Bandelin公司，型號：SONOPULS mini20)。高電流電泳儀電源(BIO-RAD公司，型號：PowerPacTMHC)、垂直電泳槽(上海天能科技有限公司，型號：VE-180)、蛋白印記-多功能成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司，型號：GelDoc 2000)。

2 方法

2.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)

將肝癌細(xì)胞BEL-7402培養(yǎng)在含有10%胎牛血清以及1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測Sorafenib對BEL-7402細(xì)胞的增殖-毒性作用

將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為5×104mL-1。用PBS填充96孔板四周的孔后，分別設(shè)置空白對照組、正常對照組、Sorafenib各劑量組,每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別向各孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，向空白對照組各孔中加入100 μL PBS。于培養(yǎng)箱中孵育過夜。吸去96孔板中培養(yǎng)液后，向正常對照組各孔中加入100 μL培養(yǎng)液；向Sorafenib各劑量組的孔中加入100 μL不同濃度的Sorafenib藥液。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸去各孔中的溶液，向各組各孔中分別加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h左右。用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的OD值，計算出Sorafenib對BEL-7402細(xì)胞生存率的影響以及相應(yīng)的IC50值。

2.3 肝癌Sorafenib耐藥細(xì)胞的建立

采用濃度梯度遞增法建立BEL-7402/S耐藥細(xì)胞株。以濃度為1 μmol/L的Sorafenib作為初始誘導(dǎo)濃度，逐步進行濃度爬坡。每2～3周爬坡1次。每次爬坡的濃度約提高1.2～1.5倍左右。根據(jù)細(xì)胞的具體狀態(tài)調(diào)整合適的爬坡濃度，最終得到穩(wěn)定的能耐受4 μmol/L Sorafenib的BEL-7402/S耐藥細(xì)胞株。將耐藥細(xì)胞株置于含有0.2 μmol/L Sorafenib的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以維持其耐藥性。于實驗前1周左右，將耐藥細(xì)胞恢復(fù)至正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗。

2.4 CCK-8法檢測槐耳顆粒對BEL-7402/S細(xì)胞的增殖-毒性作用

實驗方法同步驟2.2。以未加藥處理的BEL-7402/S細(xì)胞作為正常對照。實驗分為空白對照組、正常對照組、不同濃度的槐耳顆粒劑量組。酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的OD值，計算出槐耳顆粒對BEL-7402/S細(xì)胞生存率的影響以及IC50值。

2.5 CCK-8法檢測槐耳顆粒對BEL-7402/S細(xì)胞耐藥性的影響

采用非細(xì)胞毒性劑量的槐耳顆粒來進行逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對Sorafenib的耐藥實驗。實驗方法同步驟2.2。實驗分為空白對照組、正常對照組、Sorafenib組、槐耳顆粒+Sorafenib組。通過測定各孔OD值計算出各組別的IC50值以及槐耳顆粒的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=IC50(Sorafenib組)/IC50(槐耳顆粒+Sorafenib組)。

2.6 qPCR法檢測槐耳顆粒對BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF mRNA水平的影響

使用6孔板接種適量BEL-7402/S細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達到60%～70%時，在對照組中加入Sorafenib藥液，在實驗組中加入1 mg/mL槐耳顆粒與Sorafenib藥液。48 h后，使用TRIzol試劑分別提取各組細(xì)胞的總RNA，并用DEPC水稀釋至同一濃度。按照5×All-In-One RT MasterMix試劑盒的要求配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，使用梯度PCR儀設(shè)置相應(yīng)程序，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作。具體程序如下：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。將RNA逆轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA放置于冰上，按照EvaGreen 2×qRCR MasterMix試劑盒的要求配制qPCR反應(yīng)體系。引物序列如表1所示。通過2-△△Ct計算出實驗組目的基因的表達相對于正常對照組目的基因的變化倍數(shù)。

表1 各基因引物序列與長度

2.7 Western blot法檢測槐耳顆粒對BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白水平的影響

細(xì)胞分組、培養(yǎng)、給藥同步驟2.6。在給藥48 h后，使用加入了蛋白酶抑制劑的PIPA裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎得到蛋白液。通過BCA定量法測定蛋白液的濃度，將不同組別樣品用PIPA裂解液平衡至同一濃度。加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻后置于干式恒溫器中變性。在配制好蛋白凝膠后，將各組樣品上樣。通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色的步驟進行Western blot實驗，檢測相關(guān)蛋白的表達水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Sorafenib對BEL-7402細(xì)胞的增殖-毒性作用

結(jié)果如圖1所示，使用不同濃度的Sorafenib處理BEL-7402細(xì)胞48 h后，均對細(xì)胞活性產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。使用SPSS軟件回歸分析中的Probit分析，在置信限度中估算出Sorafenib對BEL-7402細(xì)胞的增殖-毒性作用的IC50值為10.620 μmol/L。

3.2 槐耳顆粒對BEL-7402/S細(xì)胞的增殖-毒性作用

結(jié)果如圖2所示，使用不同濃度的槐耳顆粒處理BEL-7402/S細(xì)胞48 h后，均對細(xì)胞活性產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。與對照組相比，當(dāng)濃度達到8 mg/mL及以上時，藥物對細(xì)胞活性產(chǎn)生了顯著性抑制作用(P<0.05)。使用SPSS軟件估算出槐耳顆粒對BEL-7402/S細(xì)胞的增殖-毒性作用的IC50值為10.117 mg/mL。

3.3 槐耳顆粒逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對Sorafenib耐藥的作用

選擇濃度為1 mg/mL的非毒性劑量(抑制率<5%)的槐耳顆粒來進行逆轉(zhuǎn)BEL-7402/S細(xì)胞對Sorafenib的耐藥實驗。實驗結(jié)果如圖3所示，槐耳顆?？梢栽黾覤EL-7402/S細(xì)胞對Sorafenib的敏感性，降低IC50值，提高Sorafenib對BEL-7402/S細(xì)胞的抑制作用，其耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.08。

3.4 槐耳顆粒對BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF mRNA水平的影響

結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，槐耳顆?？梢韵抡{(diào)BEL-7402/S細(xì)胞中HIF-1α的mRNA水平(P<0.05)，但對VEGF的mRNA水平無顯著性影響。

3.5 槐耳顆粒對BEL-7402/S細(xì)胞HIF-1α及VEGF蛋白表達水平的影響

結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，槐耳顆?？梢韵抡{(diào)HIF-1α、VEGF的蛋白表達水平(P<0.05)，從而緩解并部分逆轉(zhuǎn)了BEL-7402/S細(xì)胞對Sorafenib的耐藥現(xiàn)象。

4 討論

中藥槐耳是一種寄生于槐木上的木耳，為多孔菌科真菌槐栓菌TrametesrobiniophilaMurr.的子實體，又稱為槐檽、槐菌、槐雞、槐鵝、赤雞等，廣泛分布于河北、陜西、山東、四川、重慶等地區(qū)?；倍云?、味苦辛，無毒，具有抗腫瘤、止血、免疫調(diào)節(jié)等功效。近年來，槐耳主要被應(yīng)用于腫瘤治療相關(guān)領(lǐng)域，并且取得了巨大成功。醫(yī)學(xué)界及科研學(xué)術(shù)界對槐耳進行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)槐耳可以對抗多種癌癥，其內(nèi)容涉及抑制腫瘤細(xì)胞增殖[12-14]、促進腫瘤細(xì)胞凋亡[15-16]、抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[17-19]、增加放療及化療敏感性[20-21]等多個方面。

槐耳顆粒是由藥用真菌槐耳經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)工藝加工而成的顆粒劑，常用于原發(fā)性肝癌、肺癌、乳腺癌、腸癌的輔助治療。在標(biāo)準(zhǔn)化療藥抗癌的基礎(chǔ)上，槐耳顆?？梢赃M一步提高抗癌療效，延長患者生存期并改善患者生活質(zhì)量。2018年發(fā)表在權(quán)威雜志Gut上的文章指出，槐耳顆粒可以使肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率顯著降低，生存期顯著延長[22]。除了具有直接的抗癌作用外，槐耳顆粒逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的功效同樣值得關(guān)注。已有大量研究指出，槐耳顆?？梢阅孓D(zhuǎn)多種腫瘤耐藥細(xì)胞株的耐藥現(xiàn)象，其中包括逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7/ADM對阿霉素的耐藥[9]，人肺腺癌細(xì)胞株A2/cDDP對順鉑的耐藥[10]，人肝癌細(xì)胞對奧沙利鉑[23]以及氟尿嘧啶的耐藥[7]等。這說明槐耳顆?？赡苁怯行孓D(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的藥物。

腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥等方面密切相關(guān)。已有研究指出，通常在Sorafenib耐藥的肝癌細(xì)胞及組織中，缺氧微環(huán)境會導(dǎo)致HIF-1α呈現(xiàn)高表達，并進一步誘導(dǎo)HIF-1α下游因子VEGF的表達，而抑制HIF-1α的表達則可以緩解肝癌細(xì)胞對Sorafenib的耐藥[24-26]。

綜上所述，課題組建立起了對Sorafenib耐藥的肝癌細(xì)胞株BEL-7402/S，通過體外實驗研究初步證明非細(xì)胞毒性劑量的槐耳顆粒可以增加BEL-7402/S細(xì)胞對Sorafenib的敏感性并部分逆轉(zhuǎn)耐藥現(xiàn)象，提高Sorafenib對肝癌細(xì)胞的殺傷作用，且相關(guān)的機制可能與抑制HIF-1α及VEGF的表達有關(guān)。后續(xù)實驗還將進一步對槐耳顆粒抑制Sorafenib耐藥的相關(guān)機制進行深入的探究和確證。