賈榮娣，汪華君，蔣俊，賈曉斌

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212008；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥釋藥系統(tǒng)重點實驗室，江蘇 南京 210028)

中藥根據(jù)其藥性被劃分為4類： 寒、熱、溫、涼，但是，藥性產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)至今尚未闡釋清楚。中藥藥性的分類是根據(jù)作用于機(jī)體的客觀反映，正因為中藥中所含成分/組分復(fù)雜，尚不能確定中藥的藥性是中藥中的某單一成分的作用還是所含多種成分/組分的綜合體現(xiàn)，這是一個亟需解決科學(xué)難題[1-3]。吳茱萸是中醫(yī)臨床的常用中藥，具有散寒止痛、助陽止瀉等功能[4]，主要含有生物堿、苦味素、有機(jī)酸類等多種成分，其中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯是主要活性成分[5]。吳茱萸堿和吳茱萸次堿同為吳茱萸中生物堿類成分，研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿和吳茱萸次堿對體溫的影響不同，其中，吳茱萸堿會使臍部的溫度升高，而吳茱萸次堿則使臍部的溫度降低。因此，不同成分/組分具有不同的寒熱藥性。

寒熱藥性研究的技術(shù)方法是其研究瓶頸，大量研究表明動物對溫度具有一定的選擇性,表現(xiàn)出溫度趨向性，這種溫度趨向性受機(jī)體能量狀態(tài)變化的影響[6-10]。由此可見，機(jī)體對寒熱環(huán)境適應(yīng)性的差異可能是中藥對機(jī)體能量代謝干預(yù)的結(jié)果，也可以認(rèn)為是中藥寒熱藥性的某種表達(dá)方式。肖小河團(tuán)隊創(chuàng)新性地提出了基于動物溫度趨向行為學(xué)的冷熱板示差法[11-15]，這一技術(shù)也成功地評價了黃連、吳茱萸及黃連吳茱萸藥對的寒熱藥性，眾多科學(xué)家也將這一模型應(yīng)用到了中藥炮制和配伍前后的藥性評價[16-17]。但是，迄今為止，針對同一味藥物的不同組分進(jìn)行的寒熱藥性評價鮮有報道。本研究采用冷熱板示差法探討吳茱萸多組分的寒熱藥性與動物溫度環(huán)境趨向性、ATP酶活力以及能量代謝的內(nèi)在聯(lián)系，建立吳茱萸中不同組分的寒熱藥性客觀評價方法，探討熱性中藥吳茱萸藥性的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

PB60-2E型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；R-220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Buchi公司)；HH-6型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(金壇市丹瑞電器廠)；HB3型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；ATP酶試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 藥物制備和劑量

吳茱萸采用水煎法：取吳茱萸適量，10倍量的水煎煮1 h后，過濾，8倍量的水煎煮1 h后，過濾并合并2次濾液，減壓濃縮后得吳茱萸水提取物，合生藥量0.2 g/mL。黃連總生物堿的制備，按照文獻(xiàn)方法[18]，采用70%乙醇回流提取，料液比為1∶15，煎煮3次，每次時間為1.5 h，合并提取液，減壓濃縮，制備黃連總生物堿，濃度為0.2 g/mL。

1.3 動物給藥及分組處理

清潔級KM小鼠，雄性，體質(zhì)量18～20 g，動物許可證號：SYXK(蘇)2013-0036,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。期間自由飲食、飲水，溫度(20±2)℃，濕度60%～80%。

將小鼠隨機(jī)分成空白組、黃連總生物堿組、吳茱萸水提物組、吳茱萸醇洗脫組(水洗組)、吳茱萸水提物20%醇洗脫組(20)、吳茱萸水提物40%醇洗脫組(40)、吳茱萸水提物60%醇洗脫組(60)、吳茱萸水提物80%醇洗脫組(80),每組10只。實驗開始前30 min，使小鼠感受不同溫區(qū)的溫度，學(xué)習(xí)記憶不同溫區(qū)的位置。給藥前測定小鼠肛溫，淘汰體溫差異較大者。黃連組、吳茱萸組分別灌胃黃連、吳茱萸水煎液5 g/kg，各部位組分按照相同生藥量(5 g/kg)灌胃給藥，空白組給予同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。

1.4 吳茱萸各組分的制備

AB-8大孔樹脂應(yīng)用廣泛，適宜用水溶性、具有弱極性物質(zhì)的分離、純化，并廣泛用于生物堿、鞣質(zhì)、多糖、黃酮等組分的分離。選用AB-8型大孔樹脂分離吳茱萸中組分，從水洗部位得到酚酸類組分(綠原酸)、60%醇洗部位得到了苦味素類組分(吳茱萸內(nèi)酯)、80%醇洗部位得到了生物堿類組分(吳茱萸堿和吳茱萸次堿)，20%醇洗部位和40%醇洗部位的組分類型待進(jìn)一步解析。為了對比各洗脫部位的化學(xué)成分差異，各組分均在相同的HPLC條件下進(jìn)行分離分析(流動相：乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫程序：0～7 min,5%～8%乙腈;7～13 min,8%～11%乙腈;13～40 min,11%～40%乙腈;40～70 min,40%～60%乙腈。流速1 mL/min，檢測波長205、225、324 nm；柱溫：25 ℃)，代表性的HPLC圖譜如圖1所示。

A.水洗部位；B.20%醇洗部位；C.40%醇洗部位；D.60%醇洗部位； E.80%醇洗部位；F.4種化合物混標(biāo)溶液;1.綠原酸;2.吳茱萸內(nèi)酯;3.吳茱萸堿;4.吳茱萸次堿

圖1AB-8大孔樹脂制備吳茱萸各洗脫部位的HPLC色譜圖

1.5 小鼠溫度趨向性測定[11-15]

選用3個數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，分別控制3個不同的溫度區(qū)域(20、35、50 ℃)，在3個溫度區(qū)域上裝上一自制擋板，將水浴鍋上的溫區(qū)均勻地劃分成4道，每一道均同時包含3個溫區(qū)，不同組別的實驗小鼠將被分別放入其中，待小鼠熟悉環(huán)境后，秒表計時，統(tǒng)計一段時間內(nèi)各組小鼠在不同溫區(qū)的總停留時間。實驗室溫度(20±2)℃，水浴溫控系統(tǒng)溫度設(shè)置：低溫板20 ℃，中溫板35 ℃，高溫板50 ℃?？疾煅b置示意圖，如圖2。每次給藥1 h后，將小鼠依次放入冷熱板上各通道內(nèi)，待其熟悉各溫區(qū)的位置后，監(jiān)測并記錄其在不同溫區(qū)的趨向活動，記錄時間為1 h。停留比例=各溫區(qū)停留時間/總監(jiān)測時間×100%。

1.6 小鼠肝組織Na+-K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性測定

處死小鼠后取其肝臟，精密稱量，制備成2%的肝組織勻漿，采用定磷法測定ATP酶活性。其活性以每1 h每1 mg組織蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量作為一個ATP酶活力單位(U/mg)。

1.7 小鼠耗氧量、產(chǎn)熱量和能量代謝率的檢測

各組小鼠，最后1次灌胃30 min后，待其呼吸耗氧量穩(wěn)定，放入250 mL玻璃磨砂代謝瓶(含鈉石灰6 g)，橡膠瓶塞穿過1支溫度計用于檢測瓶內(nèi)溫度，瓶內(nèi)和瓶塞均用凡士林涂抹密封，與瓶內(nèi)相通的兩條膠管，一條連接裝有20 mL新鮮空氣的注射器，另一條連接水測壓計，不斷向瓶內(nèi)注入新鮮空氣保持水測壓計的水平面維持在瓶口密封時的刻度，記錄1 h注入瓶內(nèi)的空氣量，根據(jù)《動物生理學(xué)實驗》測算[19]小鼠1 h的耗氧量、產(chǎn)熱量、能量代謝率，每次試驗前后稱小鼠的體質(zhì)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠溫度趨向性行為比較

結(jié)果見表1。

2.2 小鼠肝組織ATP酶活性的變化

結(jié)果見表2。

2.3 小鼠耗氧量、產(chǎn)熱量和能量代謝率的變化

結(jié)果見圖3。

表1 小鼠在各溫區(qū)的總停留時間比例

注：與空白組比較,*P<0.05。

表2 小鼠肝組織中鈉鉀ATPase、鈣ATPase及鎂ATPase活力的比較

注：與空白組比較,*P<0.05。

圖3小鼠耗氧量、產(chǎn)熱量和能量代謝率的比較

3 討論

綜合各組對小鼠溫度趨向性、ATP酶活性和基礎(chǔ)能量代謝的影響，雖然吳茱萸的水提取物體現(xiàn)出了熱性，但是吳茱萸水提取物中的多個組分卻有截然不同的寒、熱藥性。其中，吳茱萸水提液中的水洗脫部分體現(xiàn)出了寒性，應(yīng)歸屬于寒性組分；吳茱萸水提液中的20%醇洗部位、60%醇洗部位、80%醇洗部位組分體現(xiàn)出了熱性，應(yīng)歸屬于熱性組分；吳茱萸水提液中的40%醇洗部位組分體現(xiàn)出了平性，對吳茱萸的整體藥性無特異性趨向。因此，吳茱萸整體上所表現(xiàn)出的熱性，是在寒性組分和熱性組分相互作用后的藥效作用的綜合或加和作用，其中包含了熱性組分抵抗寒性組分，熱性組分的強(qiáng)度大于寒熱組分的強(qiáng)度，則寒性組分的寒性展現(xiàn)不出來，而吳茱萸整體(水提物)最終體現(xiàn)出了熱性，實質(zhì)是其內(nèi)部熱性組分的熱性對抗了寒性組分的寒性的復(fù)雜過程。

中藥本身即是一個復(fù)雜的整體，有其相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，即相應(yīng)的“組分結(jié)構(gòu)”，而中藥的藥性即為中藥中復(fù)雜的組分結(jié)構(gòu)作用于人體后的綜合體現(xiàn)[20-24]。而中藥的藥性即為中藥所具有的組分結(jié)構(gòu)作用于人體后的綜合體現(xiàn)。中藥中的各組成分/組分均可表現(xiàn)相應(yīng)的藥性屬性(寒熱溫涼)，組分與組分之間以及組分內(nèi)部都存在著藥性差異，若成分/組分之間的藥性相同，表現(xiàn)為協(xié)同作用，能增強(qiáng)這一藥性，若成分/組分之間的藥性相者，則藥性會相互抵消。后續(xù)文章中將根據(jù)“組分結(jié)構(gòu)”假說,探討中藥的配伍和炮制機(jī)制。