顧曉群，余黎，武相，白宇，徐奚如，張靜，周春梅，張彪

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為主要癥狀[2]，伴有腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)炎癥等病理表現(xiàn)[3]。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無公認(rèn)有效的治療手段。

補(bǔ)腎益智方是臨床驗(yàn)方，采用補(bǔ)腎活血化痰醒竅法，在干預(yù)老年遺忘型輕度認(rèn)知障礙(Amnestic mild cognitive impairment,aMCI)中取得了較好的臨床效果[4]，能夠有效改善患者的認(rèn)知，提高M(jìn)oCA量表評分及中醫(yī)癥候評分。補(bǔ)腎益智方以枸杞、黨參、山萸肉補(bǔ)腎健脾為君，白術(shù)、熟地、益智仁健脾益腎為臣，郁金、當(dāng)歸、菖蒲和遠(yuǎn)志活血化痰為佐，川芎引藥上行為使，方中諸藥合用使髓海充盈，血脈通暢。本實(shí)驗(yàn)利用斑馬魚模型對補(bǔ)腎益智方干預(yù)AD的療效和作用機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚屬AB品系，6月齡，購于南京堯順禹生物科技有限公司。斑馬魚飼養(yǎng)于獨(dú)立的養(yǎng)殖系統(tǒng)中，每缸放置斑馬魚10～12條，水溫26～30 ℃，電導(dǎo)率550～580 μS/cm，pH值為7.0～7.5，光照周期為光照∶黑暗=14 h∶10 h，每日定時(shí)喂食豐年蝦2次。

1.2 主要試劑

六水合氯化鋁(AlCl3·6H2O,分析純,南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號：160427899D)；鹽酸多奈哌齊(北京華威銳科化工有限公司，批號：HW18C2607-2)；補(bǔ)腎益智方飲片(江蘇省中醫(yī)院)；引物(上海生工生物工程股份有限公司)；乙酰膽堿酯酶(ACHE)測試盒、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號：20180118，20180122)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script RT Master Mix)、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Tap TM)(愛必夢生物科技有限公司，批號：009983473)；Anti-BACE1 Antibody(Proteintech，批號：00054471)；Anti-APP Antibody(Biorbyt，批號：DF4488)；Anti-Nrf2 Antibody、Anti-Keap1 Antibody(LifeSpan Biosciences，批號：64364，147565)；Anti-beta-actin Antibody HRP(杭州華安生物有限公司，批號：HL0926)；羊抗兔抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：AH11279138)。

1.3 儀器

T型迷宮(自制)；臺式高速冷凍離心機(jī)(艾本德中國有限公司，型號：5417R)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司，型號：7500)；超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀(GE醫(yī)療生命科學(xué)部，型號：LAS4000)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 染毒 實(shí)驗(yàn)選取同一批斑馬魚，隨機(jī)分成5組，分為空白對照組、模型組、陽性藥組、補(bǔ)腎益智方高劑量組和低劑量組，每組12條。除空白對照組，其余各組均用AlCl3·6H2O配制成濃度為100 μg/L的溶液持續(xù)浸泡斑馬魚30 d，每日更換一半的染毒培養(yǎng)液。染毒結(jié)束后利用T迷宮實(shí)驗(yàn)剔除染毒失敗的斑馬魚，造模成功的模型組10條、陽性藥組10條、補(bǔ)腎益智方高劑量組11條和低劑量組12條。

1.4.2 藥物干預(yù)

1.4.2.1 中藥制備 補(bǔ)腎益智方組成：枸杞20 g，黨參15 g，山萸肉12 g，白術(shù)10 g，熟地15 g，益智仁6 g，郁金10 g，當(dāng)歸10 g，石菖蒲8 g，遠(yuǎn)志6 g，川芎10 g。取補(bǔ)腎益智方全方5劑，先用10倍水浸泡0.5 h，煎煮1 h，過濾，再用5倍水煎煮1 h，過濾，2次藥液混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至610 mL左右，生藥量約1 g/mL。用純水稀釋成1 mg/mL濃度的母液，分裝數(shù)管，凍存于-20 ℃冰箱。

1.4.2.2 給藥 造模結(jié)束后，分別給予模型組常規(guī)培養(yǎng)液，陽性藥組鹽酸多奈哌齊20 μg/mL，高、低劑量組補(bǔ)腎益智方30、10 μg/mL浸泡斑馬魚14 d，每日更換一半的新鮮藥液。

1.4.3 T迷宮實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)所用T型迷宮如圖1所示，迷宮由水平等長的左右臂和垂直甬道組成，右臂與營養(yǎng)豐富區(qū)(Enriched chamber,EC)相連，EC區(qū)底部鋪滿營養(yǎng)泥，左上角設(shè)有人工綠植，右下角放有裝有5只斑馬魚的燒杯。在給藥結(jié)束之后，按照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行T迷宮測試，測試前1 d，給予測試斑馬魚1個(gè)適應(yīng)期，讓其在迷宮內(nèi)自由活動20 min。測試當(dāng)天，在甬道起點(diǎn)放入測試魚，讓其在T迷宮中自由活動，測試時(shí)間6 min，觀察并記錄魚從起點(diǎn)到找到EC區(qū)的潛伏時(shí)間，測試結(jié)束后給予食物獎(jiǎng)勵(lì)。未找到EC區(qū)的魚，在6 min后引導(dǎo)其進(jìn)入EC區(qū)并停留3 min，同樣給予食物獎(jiǎng)勵(lì)。每條測試魚都有1個(gè)對應(yīng)編號的獨(dú)立容器，測試結(jié)束后放回各自容器中。每天測試1次，共測試4 d，記錄每次潛伏時(shí)間，以4 d潛伏時(shí)間的變化情況作為考察其學(xué)習(xí)記憶能力的主要指標(biāo)。

1.4.4 ACHE、ChAT的活力測定 T迷宮實(shí)驗(yàn)后，每組隨機(jī)取3只斑馬魚，冰上快去取腦，以質(zhì)量∶體積=1∶9制備10%腦組織勻漿，2 500 r/min離心15 min，取上清，按試劑盒說明書進(jìn)行ACHE、ChAT酶活力測試。

1.4.5 免疫組織化學(xué)染色 T迷宮實(shí)驗(yàn)后，每組隨機(jī)取3只斑馬魚，剪下魚頭用4%多聚甲醛固定24 h，5%乙酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5 μm。取包埋后的切片，室溫脫蠟、水化，熱抗原修復(fù)，用3%過氧化氫滅活內(nèi)源酶活性，封閉非特異性位點(diǎn)后，一抗4 ℃孵育過夜。選用神經(jīng)核抗原(NeuN)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的一抗分別標(biāo)記神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞。復(fù)溫、清洗，孵二抗，滴加DAB溶液，顯微鏡下觀察，染色合適即用自來水沖洗終止染色，蘇木素復(fù)染1～2 min，細(xì)胞核變藍(lán)色時(shí)終止，1%鹽酸酒精分化3 s，乙醇、二甲苯梯度脫水，晾干片子后滴加適量中性樹膠封片，蓋上蓋玻片，顯微鏡下拍照。

1.4.6 qPCR檢測 將剩余的斑馬魚在冰上快速取腦，每個(gè)樣品加500 μL的Trizol進(jìn)行勻漿，加100 μL氯仿4 ℃ 12 000×g離心15 min后分層，取上層清液加入等體積異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，DEPC水溶解得到樣品總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書實(shí)驗(yàn)步驟，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，凍存于-80 ℃冰箱。再根據(jù)qPCR試劑盒說明書，對淀粉樣前體蛋白(APP)、β-分泌酶(BACE1)、γ-分泌酶(γ-Secretase)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)的mRNA進(jìn)行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.7 Western blot檢測

1.4.7.1 蛋白質(zhì)提取 取Trizol、氯仿混合分層后的下層紅色水相，加入0.3 mL無水乙醇，4 ℃ 2 000×g離心5 min，吸取上層酚醇有機(jī)相，加1.5 mL異丙醇，4 ℃ 12 000×g離心10 min，沉淀即為蛋白。用洗滌液2 mL(鹽酸胍溶于95%乙醇中，濃度為0.3 mol/L)清洗沉淀3次。每次清洗先將沉淀保留于清洗液中20 min，后在4 ℃ 7 500×g離心5 min。然后將沉淀真空干燥5～10 min，溶解于1%SDS中，50 ℃水浴，用Tip頭反復(fù)吹打助溶，不溶物在4 ℃ 10 000×g離心10 min后去除。

1.4.7.2 蛋白表達(dá)檢測 用BCA法測定蛋白濃度，配平，加入4×樣品緩沖液，95 ℃變性5～10 min。分別配置8%的分離膠和5%濃縮膠，上樣量為20 μg；80 V電泳30 min后，120 V 1.5～2 h。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)，100 V 120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBS-T清洗3次，每次5 min。隨后用5%脫脂奶粉稀釋一抗，BACE1(1∶1 000)、APP(1∶1 000)、Keap1(1∶2 000)、β-actin(1∶4 000)，5%BSA稀釋Nrf2(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，TBS-T清洗5次，每次5 min。用5%脫脂奶粉稀釋的二抗(1∶6 000)室溫孵育2 h，TBS-T清洗5次，每次5 min。按照ECL發(fā)光液說明書，將A液和B液1∶1混合，將條帶放入發(fā)光液中顯影。運(yùn)用Image J對條帶面積和灰度值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 T迷宮實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表2。

表2 各組斑馬魚潛伏時(shí)間比較

注：與空白對照組相比，△P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

如表2所示，T迷宮實(shí)驗(yàn)的前3 d，各組斑馬魚的潛伏時(shí)間無明顯差異。第4天起，與空白對照組相比，模型組的潛伏時(shí)間明顯延長(P<0.05)，陽性藥組、補(bǔ)腎益智方低劑量組和高劑量組之間潛伏時(shí)間無明顯差異；與模型組相比，陽性藥組、中藥組潛伏時(shí)間均有明顯縮短(P<0.05)，以高劑量組最為顯著。

2.2 免疫組化染色

斑馬魚腦組織免疫組化染色結(jié)果(圖2～3)顯示，模型組的端腦神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較正常組明顯減少，排列紊亂，星型膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不可見；與模型組相比，高、低劑量的補(bǔ)腎益智方干預(yù)后，端腦神經(jīng)元數(shù)量較模型組明顯增多、排列更有序，星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加。運(yùn)用Image J軟件對陽性區(qū)域面積及光密度進(jìn)行分析(圖4)，與模型組相比，補(bǔ)腎益智方高劑量組斑馬魚端腦NeuN陽性區(qū)域總光密度顯著提高(P<0.01)，補(bǔ)腎益智方高、低劑量組斑馬魚端腦GFAP陽性區(qū)域總光密度顯著提高(P<0.05～0.01)。

2.3 ACHE和ChAT活力測定

結(jié)果見圖5，與模型組相比，陽性藥組和補(bǔ)腎益智方低、高劑量組ACHE活力顯著降低(P<0.05～0.01)，陽性藥組及補(bǔ)腎益智方高劑量組ChAT活力顯著增加(P<0.05～0.01)。

圖2斑馬魚腦組織神經(jīng)元免疫組化染色

注：與空白對照組相比，△△P<0.01； 與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。
圖4斑馬魚腦組織免疫組化染色陽性區(qū)域光密度比較

2.4 補(bǔ)腎益智方對斑馬魚腦組織Aβ生成相關(guān)基因表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果(圖6)表明，與空白對照組相比，模型組Aβ生成相關(guān)的appb、bace1、aph-1基因表達(dá)明顯增高(P<0.01)，陽性藥組、補(bǔ)腎益智方高劑量組與空白對照組之間無明顯差異。與模型組相比，陽性藥組appb、bace1表達(dá)明顯降低(P<0.05),補(bǔ)腎益智方高劑量組appb、bace1表達(dá)呈現(xiàn)極顯著的降低(P<0.01)；補(bǔ)腎益智方低劑量組對appb、bace1基因表達(dá)的影響不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，陽性藥組、補(bǔ)腎益智方高、低劑量組aph-1基因表達(dá)無明顯差異。

2.5 補(bǔ)腎益智方對斑馬魚腦組織氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

結(jié)果見圖7，與模型組相比，補(bǔ)腎益智方高劑量組sod、cat、nrf2基因表達(dá)顯著增加(P<0.01)，keap1表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與空白對照組相比，模型組sod、cat的表達(dá)略高于空白對照組，與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，陽性藥干預(yù)組的sod表達(dá)略低于模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 補(bǔ)腎益智方對斑馬魚腦組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

斑馬魚腦組織Western blot檢測結(jié)果如圖8所示，與模型組相比，經(jīng)補(bǔ)腎益智方干預(yù)后，APP、BACE1、Nrf2、Keap1的蛋白表達(dá)均有顯著變化。其中，高劑量組APP蛋白表達(dá)與模型組相比顯著降低(P<0.05)，Nrf2蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.01)，BACE1、Keap1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。

3 討論

AD是嚴(yán)重威脅老年人健康的疾病之一，患者通常表現(xiàn)為腦中Aβ沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)、乙酰膽堿含量降低、神經(jīng)炎癥等。Aβ沉積是AD最為典型的病理改變，與淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的代謝異常密切相關(guān)，β-分泌酶和γ-分泌酶是Aβ沉積的關(guān)鍵剪切酶[6-7]。β-分泌酶和γ-分泌酶的增加會加速APP分解，產(chǎn)生大量Aβ，引發(fā)一系列的病理改變，包括神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)等[8-9]。神經(jīng)元凋亡是AD患者常見的腦部病理變化，常伴有星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少、功能低下等。星型膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)唯一具有糖原儲備功能的細(xì)胞，為神經(jīng)元提供能量底物和還原當(dāng)量，調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動[10]，并且對淀粉樣蛋白的清除有關(guān)鍵作用[11]。在AD的進(jìn)程中，星型膠質(zhì)細(xì)胞的衰減，不利于淀粉樣蛋白的清除，從而加重斑塊形成。AD的一系列病理改變會引起腦部的氧化應(yīng)激反應(yīng)，SOD和CAT是人體內(nèi)清除氧自由基的主要酶，是機(jī)體對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵酶[12-13]，Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激中的關(guān)鍵因子，通常與Keap1結(jié)合發(fā)揮作用，在發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，兩者解離活化[14]。在AD患者體內(nèi)，這些因子往往表達(dá)異常，是機(jī)體抗氧化能力下降的表現(xiàn)。此外，乙酰膽堿的含量與AD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[15]，因其檢測難度大，一般由ACHE和ChAT的活力來間接反映，ACHE是乙酰膽堿水解酶，ChAT是乙酰膽堿主要的合成酶，AD患者常表現(xiàn)為ACHE活力增加，ChAT活力降低[16-17]。AD是一種復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，針對單一靶點(diǎn)的治療難以取效，因此，在治療時(shí)，應(yīng)盡可能兼顧各個(gè)靶點(diǎn)，減少Aβ生成、增加乙酰膽堿含量的同時(shí)，改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，才能有效改善AD。

斑馬魚是一種新型的模式動物，與人類基因高度相似，擁有主要的神經(jīng)電生理系統(tǒng)，包括神經(jīng)遞質(zhì)受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶的合成代謝等，能模擬AD等復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)疾病，已成為AD研究中的新載體，具有簡便、高效等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合斑馬魚在藥物篩選中高通量的特點(diǎn)以及中藥復(fù)方多靶點(diǎn)多層面的優(yōu)勢，對補(bǔ)腎益智方干預(yù)AD的療效和可能的作用機(jī)制進(jìn)行探究。

本實(shí)驗(yàn)首先通過T迷宮實(shí)驗(yàn)檢測斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶功能，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益智方能夠縮短潛伏時(shí)間，有效改善斑馬魚的認(rèn)知。為了更直觀地觀察補(bǔ)腎益智方對斑馬魚腦組織神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞的作用，我們通過免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益智方干預(yù)后，斑馬魚腦中神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及陽性區(qū)域總光密度值顯著增加，說明補(bǔ)腎益智方能有效促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)和再生，提高星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目，從而增加腦內(nèi)能量供應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元活動。

本實(shí)驗(yàn)檢測了ACHE和ChAT酶的活力，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益智方干預(yù)AD斑馬魚后，有效地增加了ChAT活力，同時(shí)降低ACHE活力，一定程度上提高了斑馬魚腦中乙酰膽堿的含量。接著，運(yùn)用qPCR技術(shù)對斑馬魚腦組織的appb、bace1、aph-1、sod、cat、nrf2、keap1基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，補(bǔ)腎益智方組appb、bace1的表達(dá)顯著降低，說明補(bǔ)腎益智方能通過降低APP和β-分泌酶，來減少Aβ的產(chǎn)生。以往的研究表明，大部分β-分泌酶抑制劑在減少β-分泌酶表達(dá)的同時(shí)，會降低γ-分泌酶的表達(dá)，并通過Notch信號通路產(chǎn)生一定的副作用。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益智方的干預(yù)不會對γ-分泌酶的表達(dá)產(chǎn)生影響，一定程度上避免了經(jīng)Notch信號通路產(chǎn)生的副作用。同時(shí)，補(bǔ)腎益智方還能通過增加sod、cat基因的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，同時(shí)增加nrf2的表達(dá)，誘導(dǎo)其與keap1結(jié)合，進(jìn)入非活性狀態(tài)，達(dá)到抗氧化應(yīng)激的作用。最后，通過Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，與qPCR結(jié)果一致，補(bǔ)腎益智方能夠降低APP、BACE1的蛋白表達(dá)，增加Nrf2以結(jié)合Keap1，從而減少Keap1的表達(dá)。

綜上所述，補(bǔ)腎益智方能夠有效地改善AD斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力，減少Aβ生成，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善AD內(nèi)環(huán)境，從而達(dá)到改善AD癥狀的作用。本研究豐富了補(bǔ)腎益智方的科學(xué)內(nèi)涵，為中醫(yī)藥干預(yù)AD提供了依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)還存在著一些不足，斑馬魚作為一種新型的動物模型，商業(yè)化抗體較少，文中涉及的一些指標(biāo)蛋白尚無法檢測，未來隨著斑馬魚的廣泛應(yīng)用，將進(jìn)行更為廣泛和深入的研究。