甘嘯陽，王威，呂楊，陳玉萍，盧金福，呂高虹，劉成鼎，許惠琴

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥藥效與安全評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；3.南京大學(xué)金陵學(xué)院，江蘇 南京 210023；4.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江蘇 鹽城 224005；5.重慶市墊江縣中醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 408300)

隨著全球范圍內(nèi)糖尿病患者人數(shù)增加，糖尿病并發(fā)癥的危害也逐漸被人們所認(rèn)知，研究發(fā)現(xiàn)慢性炎癥是眾多糖尿病并發(fā)癥發(fā)病的重要原因[1]。高血糖條件下，葡萄糖與蛋白質(zhì)反應(yīng)生成晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)，參與炎癥反應(yīng)[2]。巨噬細(xì)胞是一種廣泛存在的免疫細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)的各個(gè)階段中都起著重要作用[3]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，巨噬細(xì)胞主要通過2種極化分型參與炎癥[4]：介導(dǎo)損傷、促進(jìn)炎性因子分泌的M1型和抑制炎癥、促進(jìn)組織修復(fù)與重建的M2型，2者比例變化與動態(tài)平衡調(diào)控著炎癥的發(fā)生與進(jìn)展。

山茱萸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫的功效。馬錢苷是山茱萸主要效應(yīng)成分，具有較好的預(yù)防炎癥應(yīng)激的作用[5]，能夠下調(diào)糖尿病小鼠炎性因子IL-6和TNF-α的分泌[6]，減少ET-1、MCP-1、VCAM-1分泌，升高NO水平，對HUVEC損傷具有明顯的保護(hù)作用[7]。但目前馬錢苷對巨噬細(xì)胞炎癥的干預(yù)還未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)通過AGEs刺激巨噬細(xì)胞，觀察和探討馬錢苷對AGEs致巨噬細(xì)胞炎癥損傷的干預(yù)作用，為馬錢苷治療糖尿病慢性炎癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與試劑

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。馬錢苷標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：M-010-160516；氨基胍，Sigma公司，批號：079K1734V；IL-10、IL-12、TNF-α ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：201810；DMEM/High glucose培養(yǎng)基，美國GE公司，批號：AD20813268；胎牛血清(FBS)，Gemini公司，批號：A97E00G；iNOS抗體，Abcam公司，批號：GR241855-22；RAGE抗體，Abcam公司，批號：GR152226-5；CD206抗體，Biolegend公司，批號：B246216；CD86抗體，Biolegend公司，批號：B268255；RBP-J抗體，Abcam公司，批號：GR152226-5；IRF8抗體，Sigma公司，批號：063M4812；β-actin抗體，Bioworld公司，批號：AA1217B88ZJ2；FITC-羊抗兔IgG，博士德生物工程有限公司，批號：BST14C18B05；CY3-羊抗兔IgG，Proteintech公司，批號：20000063；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗，博士德生物工程有限公司，批號：BST12115B50；青霉素-鏈霉素溶液，碧云天生物研究所，批號：C0222；Triton-X，索萊寶科技有限公司，批號：915E053；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所，批號：P0012S；PMSF，碧云天生物技術(shù)研究所，批號：ST506；RIPA裂解液，碧云天生物技術(shù)研究所，批號：P0013B。

1.2 儀器

Synergy HT酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；垂直凝膠電泳儀，美國伯樂公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國GE公司；倒置熒光顯微鏡(Ti型)，日本尼康公司。

2 方法

2.1 AGEs的制備

將適量牛血清白蛋白(BSA)與葡萄糖溶于磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)中，使葡萄糖濃度為0.5 mol/L，BSA濃度為50 g/L，用0.22 μm濾器過濾除菌，37 ℃避光孵育4個(gè)月，形成AGEs-BSA溶液。在平行條件下同時(shí)配制不含葡萄糖的BSA溶液形成無糖基化的0-BSA溶液作為陰性對照。將孵育好的AGEs-BSA溶液，用透析袋于10 mmol/L的PBS溶液中4 ℃低溫透析24 h,以除去未反應(yīng)的葡萄糖。經(jīng)BCA蛋白定量法測定AGEs含量為22.7 g/L，同時(shí)將制備好的AGEs用0.22 μm濾器過濾除菌，-20 ℃儲存。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記蛋白表達(dá)百分率

取對數(shù)生長期的RAW264.7調(diào)整至合適密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h。將細(xì)胞分為模型組、氨基胍(10 μmol/L)組，馬錢苷低、高劑量組(1、10 μmol/L)，加入藥物預(yù)保護(hù)1 h后使用100 mg/L的AGEs刺激24 h，另設(shè)空白對照組加入100 mg/L的BSA培養(yǎng)24 h。用PBS將細(xì)胞吹打制備為細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中以900 r/min離心5 min后棄去上清，用4 ℃的PBS洗滌3次后重懸在100 μL PBS緩沖液中，每管加5 μL CD86抗體，混勻后加入5 μL CD206抗體后在4 ℃冰箱中避光孵育30 min，棄去上清，加入PBS緩沖液洗滌后上機(jī)檢測CD86、CD206蛋白表達(dá)百分率。

2.4 免疫熒光法檢測巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記蛋白iNOS、CD206的表達(dá)

取對數(shù)生長期的RAW264.7調(diào)整至合適密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h。分組與加藥處理同“2.3”項(xiàng)。培養(yǎng)24 h后，棄去上清，4%多聚甲醛固定10 min，Triton-100通透后PBS清洗3次，每孔加入100 μL 10%羊血清于4 ℃封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，次日PBS洗滌3次，加入熒光二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌后加入DAPI染色劑，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗去染料，鏡下觀察并拍照。

2.5 ELISA法檢測巨噬細(xì)胞上清液中炎癥相關(guān)因子的水平

取對數(shù)生長期的RAW264.7調(diào)整至合適密度接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)8 h。分組與加藥處理同“2.3”項(xiàng)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，提取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書，檢測細(xì)胞上清中IL-10、IL-12、TNF-α水平。

2.6 Western blot法檢測iNOS、RAGE、RBP-J、IRF8蛋白的表達(dá)

取對數(shù)生長期的RAW264.7調(diào)整至合適密度接種于6孔板中，分組與加藥處理同“2.3”項(xiàng)。培養(yǎng)24 h后，棄去細(xì)胞上清，用冰PBS洗滌3次，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度。蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，加入0.5 g/L的BSA封閉液，室溫封閉2 h后一抗4 ℃孵育過夜。次日PBST漂洗3次，每次15 min，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL顯色。利用Image J軟件分析各組灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算RAGE、RBP-J、IRF8蛋白的變化。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 馬錢苷對巨噬細(xì)胞IL-12、TNF-α和IL-10水平的影響

如圖1所示，與空白對照組相比，AGEs可明顯上調(diào)巨噬細(xì)胞IL-12、TNF-α水平(P<0.01)。馬錢苷(1、10 μmol/L)可顯著下調(diào)AGEs刺激后巨噬細(xì)胞IL-12、TNF-α水平，上調(diào)IL-10水平(P<0.05～0.01)。

3.2 馬錢苷對巨噬細(xì)胞M1標(biāo)記蛋白iNOS，CD86和M2標(biāo)記蛋白CD206的影響

流式細(xì)胞結(jié)果如圖2所示，與空白對照組相比，模型組表達(dá)CD86蛋白的巨噬細(xì)胞比例升高(P<0.01)，表達(dá)CD206蛋白的巨噬細(xì)胞無明顯變化，馬錢苷(1、10 μmol/L)能夠顯著下調(diào)CD86的表達(dá)并上調(diào)CD206表達(dá)(P<0.05～0.01)。

免疫熒光結(jié)果如圖3所示，與空白對照組相比，模型組iNOS蛋白升高(P<0.01)，CD206蛋白無明顯影響，馬錢苷(1、10 μmol/L)能夠下調(diào)iNOS的表達(dá)并上調(diào)CD206表達(dá)(P<0.01)。

3.3 馬錢苷對巨噬細(xì)胞RAGE、RBP-J、IRF8蛋白的影響

Western blot結(jié)果如圖4所示，與空白對照組相比，AGEs可明顯上調(diào)RAGE、RBP-J、IRF8蛋白的表達(dá)(P<0.01)，而給予不同濃度馬錢苷(1、10 μmol/L)后RAGE、RBP-J和IRF8表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.01)，馬錢苷對RBP-J和IRF8的抑制效果與其濃度相關(guān)，10 μmol/L濃度的馬錢苷具有較好效果。

4 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球糖尿病患者人數(shù)已高達(dá)4.25億，其各種并發(fā)癥的發(fā)病率也節(jié)節(jié)升高，而長期性低度炎癥是導(dǎo)致許多并發(fā)癥的主要原因[8]。巨噬細(xì)胞廣泛參與各種炎癥反應(yīng)，其極化分型是影響炎癥進(jìn)程的關(guān)鍵因素[9]。高血糖條件下，AGEs代謝紊亂并在腎臟積蓄，直接誘導(dǎo)和激活巨噬細(xì)胞，通過M1/M2型極化，參與炎癥反應(yīng)[2,10]：經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)iNOS、CD86等標(biāo)記蛋白，參與抗原提呈，促進(jìn)炎性因子IL-6、TNF-α的分泌進(jìn)而加劇炎性反應(yīng)[11]；而替代活化方式的M2型巨噬細(xì)胞，以甘露糖受體CD206、精氨酸酶-1為標(biāo)記分子，分泌抑炎因子抑制炎癥發(fā)展，參與損傷組織的修復(fù)和重建[12]。因此巨噬細(xì)胞的極化情況，尤其是M1/M2細(xì)胞的動態(tài)平衡則可能是糖尿病慢性炎癥治療的重要潛在靶點(diǎn)。Lu等發(fā)現(xiàn)瓜蔞凝集素通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化促進(jìn)足細(xì)胞增殖，改善DN[13]；Lee等的研究表明IL-23和IL-17參與調(diào)控巨噬細(xì)胞極化從而調(diào)節(jié)糖尿病傷口愈合[14]。本實(shí)驗(yàn)中RAW264.7經(jīng)AGEs刺激后，促炎因子IL-12、TNF-α水平升高，抑炎因子IL-10水平降低，同時(shí)M1型標(biāo)記蛋白iNOS，CD86表達(dá)升高，M2型標(biāo)記蛋白CD206無明顯改變，提示AGEs可能是通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化來加劇炎癥進(jìn)程。

RBP-J/IRF8信號通路是與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的通路，RBP-J能夠增強(qiáng)TLR4誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞關(guān)鍵介質(zhì)的表達(dá)，選擇性地促進(jìn)IRF8的合成；RBP-J的缺失能夠下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物iNOS水平和炎性因子水平[15]，而IRF8則通過參與調(diào)控下游M1型巨噬細(xì)胞基因的表達(dá)來調(diào)控巨噬細(xì)胞極化[16]。本次實(shí)驗(yàn)RAW264.7經(jīng)AGEs刺激后，RAGE、RBP-J、IRF8等極化相關(guān)蛋白表達(dá)升高，證明了AGEs可能是通過促進(jìn)RAGE表達(dá)，激活RBP-J/IRF8信號通路來調(diào)控巨噬細(xì)胞的M1型極化。

馬錢苷來源于中藥山茱萸，具有抑制神經(jīng)炎癥從而改善阿爾茨海默癥[17]，緩解氧化應(yīng)激從而調(diào)節(jié)肝臟炎癥[18]等功效。本研究發(fā)現(xiàn)，馬錢苷能夠通過干預(yù)RAGE/RBP-J/IRF8信號通路，抑制巨噬細(xì)胞的M1型極化，并促進(jìn)M2型極化。